TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
THUỐC THÚ Y - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ BÀO TỬ BACILLUS
Veterinary drugs - Method for enumeration spores of Bacillus
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đếm tổng số bào tử Bacillus, bao gồm Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis trong các loại chế phẩm sinh học dùng trong thú y.
Phương pháp này không thể phân biệt được với các loài Bacillus khác như Bacillus cereus, Bacillus anthracis. Để phân biệt được Bacillus cereus, Bacillus anthracis phải tiến hành xác định riêng theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) và phép thử tính di động bổ sung có thể giúp để phân biệt khi nghi ngờ có mặt Bacillus cereus và Bacillus anthracis.
Trên môi trường đặc, mỗi vi sinh vật hoặc mỗi bào tử đứng riêng sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. Đếm số khuẩn lạc có thể tính ra số lượng vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích của dịch nghiên cứu. Ưu điểm của phương pháp này là không phát hiện nhầm các vi sinh vật chết hoặc các mảnh xác hữu cơ.
Sử dụng phương pháp đếm thạch đĩa, đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 370C ± 10C trong 24 h. Tổng số bào tử Bacillus trong 1 g hoặc 1ml mẫu chế phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy ở các đậm độ pha loãng.
3.1 Môi trường PCA, pH 7,0 ± 0,2 có thành phần như sau:
Pepton 5,0 g
Chất chiết nấm men 2,5 g
D(+)-Glucose 1,0 g
Thạch 14,0 g
Nước cất 1 000 ml
3.2 D(+)-Glucose.
3.3 Thạch.
3.4 Natri clorua (NaCl).
3.5 Cồn.
3.6 Nước cất.
3.7 Bộ thuốc nhuộm Gram.
3.8 Natri hydroxit (NaOH).
3.9 Axit clohydric (HCl).
3.10 Hydro peroxit, 3 %.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Tủ cấy vi sinh vật.
4.2 Nồi hấp áp lực.
4.3 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 oC.
4.4 Tủ lạnh.
4.5 Máy lắc.
4.6 Máy đếm khuẩn lạc.
4. 7 Máy đo pH.
4.8 Cân phân tích, có khả năng cân chính xác đến 0,1 mg.
4.9 Kính hiển vi quang học.
4.10 Lò vi sóng.
4.11 Bể điều nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ ở 45 0C ± 1 0C và 80 oC.
4.12 Bình định mức, dung tích 1000 ml (loại A).
4.13 Bình nón.
4.14 Ống nghiệm
4.15 Pipet, dung tích 1 ml và 10 ml.
4.16 Ống đong, dung tích 100 ml và 250 ml.
4.17 Micropipet, dung tích 1000 l.
4.18 Bông không thấm nước.
5.1 Yêu cầu chung
Lấy mẫu theo nguyên tắc ngẫu nhiên.
Lượng thuốc trong mẫu phân tích cũng như trong mẫu lưu ít nhất phải đủ cho ba lần phân tích hoặc phải đủ để thực hiện các phép thử đảm bảo thu được kết quả chính xác và tin cậy. Lượng thuốc này được tính toán trên cơ sở tiêu chuẩn phương pháp thử của sản phẩm. Thông thường mỗi lô sản xuất được lấy hai mẫu (một mẫu phân tích và một mẫu lưu).
Trường hợp đặc biệt, số mẫu phân tích và mẫu lưu có thể nhiều hơn hai để đủ gửi kiểm nghiệm và lưu ở nhiều nơi nếu xét thấy cần thiết.
5.2 Lấy mẫu thành phẩm
Mẫu được lấy tại những vị trí khác nhau của lô sản xuất, không được phá lẻ các đơn vị đóng gói sản phẩm để lấy mẫu. Từ các đơn vị lấy mẫu được tập hợp lại thành mẫu chung và mẫu cuối cùng.
Số lượng mẫu thành phẩm cần lấy theo quy định tại Bảng 1.
Bảng 1 - Số lượng mẫu cần lấy theo quy cách đóng gói
Quy cách đóng gói (g hoặc ml) | Số lượng mẫu lấy (đơn vị bao gói) |
Đến 2 | 70 |
Từ 2 đến 5 | 30 |
Từ 5 đến 50 | 7 |
Từ 50 đến 100 | 4 |
Từ 100 trở lên | 3 |
Trong trường hợp đặc biệt thì tùy theo quy cách đóng gói và tính chất của thuốc chỉ lấy mẫu đủ để phân tích và lưu.
5.3 Bảo quản mẫu
Xem tiêu chuẩn cụ thể đối với sản phẩm liên quan hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
6.1 Chuẩn bị dung dịch pha loãng
Cân 9 g natri clorua, hòa tan trong nước cất đựng trong bình định mức 1000 ml, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N. Dùng ống đong cho vào bình nón mỗi bình 90 ml và dùng pipet lấy cho vào ống nghiệm mỗi ống 9 ml dung dịch trên. Đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bạc, hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 min. Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 đến 8 0C, sử dụng trong 15 ngày.
6.2 Chuẩn bị môi trường
Cân các thành phần môi trường PCA theo 4.1 hoặc lấy 22,5 g môi trường tổng hợp, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N. Lắc đều và đun cách thủy hoặc trong lò vi sóng đến khi sôi (môi trường trong). Rót vào bình 250 ml lượng môi trường 100 ml. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 0C trong 15 min.
Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45 0C ± 1 0C ở bể điều nhiệt, nếu chưa sử dụng ngay thì cần bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 đến 8 0C không quá 30 ngày.
6.3 Chuẩn bị mẫu thử
Cân vô trùng khoảng 10 g (10 ml), chính xác đến 0,1 mg, mẫu thử cho vào bình nón đựng 90 ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-1. Cho lên máy lắc đồng hoá mẫu khoảng 30 min. Đặt trong bể điều nhiệt 80 0C trong 10 min.
6.4 Các bước tiến hành
6.4.1 Pha loãng mẫu
Dùng micropipet lấy 1 ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đã đồng hóa cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng tương tự đến độ pha loãng cần thiết để đếm được từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên đĩa theo dự kiến.
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng liên tiếp, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri vô trùng.
Lấy 1 ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri.
Môi trường PCA đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 0C ± 1 0C. Rót vào từng đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái.
Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang.
Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 min.
6.5 Ủ ấm
Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 37 0C trong thời gian từ 18 h đến 24 h.
6.6 Đọc kết quả
Sau 24 h, đếm kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa.
Vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch tạo thành khuẩn lạc màu trắng, hình dạng thay đổi. Để khẳng định là Bacillus bao gồm: Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, thì tiến hành kiểm tra ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình theo cách sau: -
- Nhuộm Gram: Bacillus là trực khuẩn Gram (+) tạo thành chuỗi.
- Thử phản ứng Catalase: Bacillus cho catalase (+).
- Nhuộm Glycogen: hạt glycogen trong vi khuẩn bắt màu đỏ nâu.
- Nếu trong 80 % trường hợp, tức là không ít hơn 4 khuẩn lạc trong 5 khuẩn lạc được khẳng định là thuộc chủng Bacillus thì tất cả các khuẩn lạc đặc trưng phát triển trong đĩa được coi là thuộc nhóm này.
- Trong các trường hợp còn lại số vi khuẩn chủng Bacillus được xác định từ tỉ lệ phần trăm của khuẩn lạc đã được khẳng định trên tổng số khuẩn lạc đặc trưng được lấy để kiểm tra.
7.1 Tính kết quả
Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, thì tính số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng của tống số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa theo công thức sau:
Trong đó:
C là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2 đậm độ pha loãng tiếp theo;
V là thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml);
n1 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại;
n2 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại;
d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.
7.2 Biểu thị kết quả
Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa số 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích hợp của 10).
Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ lớn hơn 2 lần, thì lấy giá trị của đậm độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả.
Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu có ít hơn 15 khuẩn lạc tính kết quả là trung bình cộng của các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính ra cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm.
Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau:
- Ít hơn 1 khuẩn lạc Bacillus trong 1 ml sản phẩm.
- Ít hơn 1/d khuẩn lạc Bacillus trong 1 g sản phẩm.
trong đó d là hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (10-1).
Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) nhiệt độ ủ;
e) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tuỳ ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;
f) kết quả thử nghiệm thu được.