BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 26: BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU DO EHNV Ở CÁ
Aquatic Animal Disease - Diagnostic procedure -Part 26 : Epizootic haematopoietic hecrosis disease in fish
Lời nói đầu
TCVN 8710-26:2023 được xây dựng trên cơ sở tham khảo OIE/WOAH, 2021, Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animal, Chapter 2.3.2 Infection with epizootic haematopoietic necrosis virus.
TCVN 8710-26:2023 do Trung tâm Chẩn đoán thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:
- TCVN 8710-1:2011, Phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm;
- TCVN 8710-2:2019, Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển;
- TCVN 8710-3:2019, Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm;
- TCVN 8710-4:2019, Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm;
- TCVN 8710-5:2023, Phần 5: Hội chứng taura ở tôm;
- TCVN 8710-6:2019, Phần 6: Bệnh do Koi herpesvi rút ở cá chép;
- TCVN 8710-7:2019, Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép;
- TCVN 8710-8:2023, Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);
- TCVN 8710-9:2012, Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm;
- TCVN 8710-10:2015, Phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;
- TCVN 8710-11:2015, Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;
- TCVN 8710-12:2019, Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;
- TCVN 8710-13:2015, Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;
- TCVN 8710-14:2015, Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;
- TCVN 8710-15:2015, Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá;
- TCVN 8710-16:2016, Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;
- TCVN 8710-17:2016, Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;
- TCVN 8710-19:2019, Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;
- TCVN 8710-20:2019, Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;
- TCVN 8710-21:2019, Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá;
- TCVN 8710-22:2022, Phần 22: Bệnh sán lá 16 móc ở cá;
- TCVN 8710-23:2022, Phần 23: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV ở cá hồi;
- TCVN 8710-24:2022, Phần 24: Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn;
- TCVN 8710-25:2022, Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu;
- TCVN 8710-26:2023, Phần 26: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV ở cá;
- TCVN 8710-27:2023, Phần 27: Bệnh do vi rút Tilapia lake (TiLV) ở cá rô phi
- TCVN 8710-28:2023, Phần 28: Bệnh do RSIVở cá biển.
BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 26: BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU DO EHNV Ở CÁ
Aquatic Animal Disease - Diagnostic procedure -Part 26 : Epizootic haematopoietic hecrosis disease in fish
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV ở cá
2 Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt
2.1 Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:
2.1.1
Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV ở cá(Epizootic haematopoietic necrosis disease in fish)
Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút đối với các loài cá Vược, cá Hồi và một số loài cá khác.
2.1.2
Vi rút EHNV(Epizootic haematopoietic necrosis virus)
Vi rút EHNV thuộc chi Ranavirus trong họ Iridoviridae. Chi Ranavirus bao gồm: vi rút Bohle (Bohle virus - BIV), vi rút cá da trơn châu Âu (European caffish virus - ECV), vi rút cá mòi châu Âu (Europeansheatfish virus - ESV) và vi rút ranavirus Santee-Cooper. Ranavirus đã được phân lập từ ếch, kỳ nhông và bò sát khỏe mạnh hoặc bị bệnh ở Châu Mỹ, Châu Âu và Úc. Ranavirus có virion lớn (150-180 nm), hình tứ diện, bộ gen DNA sợi đôi 150-170 kb và nhân lên trong cá nhân và tế bào chất.
2.2 Các từ viết tắt
- EHNV | Epizootic haematopoietic necrosis virus; |
- ADN (Deoxyribonucleic acid): | Axit deoxyribonucleic; |
- CPE (cytopathic effect): | Bệnh lý tế bào; |
- FCS (Fetal calf serum): | Huyết thanh thai bê; |
- PBS (Phosphate buffered saline): | Dung dịch muối đệm phosphat; |
- PCR (Polymerase Chain Reaction): | Phản ứng chuỗi trùng hợp; |
- TAE (Tris-acetate-EDTA): | Tris-axetat-axit etylendiamintetraaxetic; |
- TBE (Tris-borate-EDTA): | Tris-borat-axit etylendiamintetraaxetic; |
- TE (Tris-EDTA): | Tris-axit etylendiamintetraaxetic. |
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.
3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung
3.1.1 Ethanol, từ 70 % đến ethanol tuyệt đối
3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), (xem A.2)
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp PCR
3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược PCR
3.2.2 Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic)
3.2.3 Kít nhân gen PCR
3.2.4 Dung dịch đệm TE (Tris - EDTA)
3.2.5 Thang chuẩn ADN (Ladder/ Marker)
3.2.6 Nước tinh khiết, không có nuclease
3.2.7 Thạch agarose
3.2.8 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (xem A.1)
3.2.9 Chất nhuộm màu, Ví dụ: Sybr safe
3.2.10 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)
3.3 Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào
3.3.1 Môi trường MEM (Earles)
3.3.2 Dòng tế bào BF-2
3.3.3 Kháng sinh penicillin
3.3.4 Kháng sinh streptomycin
3.3.5 Kháng sinh amphotericin B
3.3.6 Huyết thanh thai bê (FBS)
Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:
4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng chung
4.1.1 Tủ lạnh, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C
4.1.2 Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ âm 20 °C tới âm 80 °C
4.1.3 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2
4.1.4 Pipet đơn kênh các loại
4.1.5 Ống đong, dung tích 100 mL; 500 mL; 1000 mL
4.1.6 Máy ly tâm, có thể hoạt động với gia tốc 2 000 g đến 4 000 g và gia tốc 12 000 g
4.1.7 Máy nghiền mẫu
4.1.8 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg
4.1.9 Lọ dụng cụ chứa mẫu, kín, có nắp đậy, không rò rỉ, vô trùng
4.1.10 Ranh và kéo, vô trùng
4.1.11 Máy ủ nhiệt, từ 0°C đến 100 °C
4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp PCR
4.2.1 Máy nhân gen PCR
4.2.2 Máy tách chiết ADN/ARN
4.2.3 Máy lắc trộn vortex
4.2.4 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di
4.2.5 Máy đọc sản phẩm PCR
4.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào
4.3.1 Đĩa nuôi cấy 24 giếng (hoặc đĩa nuôi cấy 96 giếng)
4.3.2 Chai nuôi cấy tế bào, 25 cm2 (hoặc 75 cm2 hoặc 150 cm2)
4.3.3 Màng lọc, 0,45 μM
4.3.4 Tủ ấm lạnh, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 0 °C đến 100 °C
4.3.5 Kính hiển vi soi ngược, vật kính có độ phóng đại 4 X và 10 X
5.1 Đặc điểm dịch tễ
Các loài cá nhiễm vi rút: cá Vược vây đỏ (Perea fluviatilis), cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá Rô bạc (Bidyanus bidyanus), cá Vược Châu Âu (Sander lucioperca), cá Vược Macquarie (Macquaria australasica), cá Hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) và một số loài cá khác.
Tất cả các giai đoạn của cá đều mẫn cảm với vi rút gây bệnh EHNV nhưng ở giai đoạn cá giống và cá hồi ở giai đoạn ấu trùng thường có dấu hiệu lâm sàng rõ ràng hơn.
Các cơ quan đích bị nhiễm vi rút: thận, lá lách và gan.
EHNV có khả năng chịu khô cao. Vi rút tồn tại nhiều ngày trong nước và ít nhất 113 ngày trong mô cá khô. Nó có thể tồn tại hơn 300 ngày trong môi trường nuôi cấy tế bảo ở 4 °C và hai năm trong mô cá được bảo quản ở âm 20 °C.
Ở cá hồi, EHNV lây truyền theo chiều ngang giữa các trang trại thông qua cá giống nhiễm bệnh hay qua nguồn nước, ở cá rô Châu Âu, EHNV lây truyền qua các phương tiện, dụng cụ vận chuyển cá sống hay mồi câu của người câu cá.
Các loài chim, gia cầm có thể là các động vật trung gian truyền bệnh bởi vi rút có thể tồn tại trong đường tiêu hóa của gia cầm trong vài giờ và có thể được truyền trong thức ăn bị nôn trớ. EHNV cũng có thể được mang trên lông, chân và mỏ chim.
Cá rô đồng đỏ rất dễ bị bệnh dịch “hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV”, tỷ lệ mắc bệnh rất cao ởloài này và hầu hết cá bị nhiễm bệnh chết: tuy nhiên những con cá sống sót có khả năng không táinhiễm.
Thời gian ủ bệnh đối với cá hồi vân bị nhiễm bệnh thí nghiệm là từ 3 ngày đến 10 ngày trong nhiệt độ nước 19 °C đến 21 °C và từ 14 ngày đến 32 ngày trong nhiệt độ nước 8 °C đến 10 °C. Trong thực nghiệm nhiễm bệnh ở cá rô vây đỏ, thời gian ủ bệnh là từ 10 ngày đến 11 ngày ở 19 °C đến 21 °C, và từ 10 ngày đến 28 ngày ở 12 °C đến 18 °C.
5.2 Triệu chứng lâm sàng
- Cá bị bệnh có dấu hiệu lâm sàng không điển hình, trong đó cá rô chết đột ngột là dấu hiệu phổ biến nhất;
- Cá có thể bị mất trạng thái cân bằng, ít hoạt động, bề mặt da cá bị sạm màu, có ban đỏ quanh lỗ mũi và vùng não, xuất huyết ở mang và ở gốc vây;
- Cá hồi nhiễm vi rút EHNV có dấu hiệu sạm đen bề mặt da cá, hôn mê, chướng bụng và mất thăng bằng, loét da, có bọng nước và tấy đỏ ở gốc vây.
5.3 Dấu hiệu bệnh tích
- Cá bị bệnh có dấu hiệu lá lách và gan sưng to, tăng dịch màng bụng và nhiều ổ hoại tử ở gan. Thỉnh thoảng lá lách nhợt nhạt và teo lại, xuất hiện đốm xuất huyết trên phủ tạng.
- Có các tổn thương màu trắng đến vàng khu trú ở gan tương ứng với các vùng hoại tử.
6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
- Cá có kích thước < 4 cm: Lấy nguyên con, từ 10 con đến 15 con.
- Cá có kích thước từ 4 cm đến 6 cm: Lấy nguyên con, từ 5 con đến 10 con.
- Cá có kích thước > 6 cm: Lấy nguyên con, từ 3 con đến 5 con hoặc lấy gan, thận, lách của từ 3 con đến 5 con.
Mẫu bệnh phẩm phải được lấy vô trùng và để riêng biệt trong lọ dụng cụ chứa mẫu (4.1.9). Đối với các mẫu bệnh phẩm dự kiến nuôi cấy vi rút trên môi trường nuôi cấy tế bào cần giữ trong các lọ dụng cụ chứa môi trường nuôi cấy tế bào bổ sung kháng sinh (3.3.2).
Bảo quản vận chuyển:
Bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h khi vận chuyển về phòng thí nghiệm hoặc bảo quản trong ethanol 70 % đến ethanol tuyệt đối với tỷ lệ 1:10 (1 phần mẫu:9 phần ethanol). Trong quá trình vận chuyển các mẫu bệnh phẩm xét nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy vi rút trên môi trường nuôi cấy tế bào cần giữ trong các dụng cụ chứa môi trường nuôi cấy tế bào và bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.
Bảo quản tại phòng thí nghiệm:
Mẫu xét nghiệm bằng phương pháp PCR được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C chuyển đến phòng thí nghiệm chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc được bảo quản trong dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS) (3.1.2) theo tỷ lệ 1:10 (1 phần mẫu:9 phần PBS) ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc bảo quản trong ethanol từ 70% đến ethanol tuyệt đối.
Mẫu xét nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy tế bào bảo quản mẫu ở âm 80 °C.
6.3.1 Chuẩn bị mẫu
Dùng panh, kéo vô trùng (4.1.10) để thực hiện các thao tác: tách, cắt lấy mẫu (gan, thận, lách). Mẫu được chia thành hai phần: một phần cho thực hiện xét nghiệm và một phần lưu trữ.
Lượng mẫu lấy để tách chiết ADN khoảng 30 mg.
Cho 30 mg mẫu (6.1.1) vào dung dịch PBS (3.1.2) theo tỷ lệ 1:10 (1 phần mẫu:9 phần PBS), đồng nhất mẫu bằng máy nghiền mẫu (4.1.7) hoặc bằng cối, chày nghiền mẫu để tạo thành huyễn dịch 10 %. Chuyển huyễn dịch vào 2 ống vô trùng đóng nắp, một ống mẫu để xét nghiệm và một ống lưu mẫu.
CHÚ Ý: Với mẫu đã bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C cần rã đông ngoài nhiệt độ phòng trước khi thực hiện đồng nhất mẫu.
6.3.2 Tách chiết ADN
Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.2) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: Sử dụng kít tách chiết ADN của Qiagen: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)1) (xem phụ lục B1).
Hoặc sử dụng kit tách chiết TACO RNA/DNA extraction Kit (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests)2)(xem phụ lục B2).
6.3.3 Chuẩn bị mồi
Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (3.2.1) để phát hiện Ranavirus
Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C1).
Mồi được chuẩn bị như sau:
- Trước khi mở và hoàn nguyên, mồi phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (4.1.6) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm gốc.
- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.6) (20 μl mồi gốc và 80 μl nước tinh khiết không có nuclease).
6.3.4 Tiến hành phản ứng PCR
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR sử dụng cặp mồi xuôi, ngược sử dụng kit nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, (xem phụ lục c, Bảng C2, C3).
6.3.5 Chạy điện di
6.3.5.1 Chuẩn bị bản thạch
Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.7) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.8) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;
Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 μl chất nhuộm màu (3.2.9) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.
Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.
Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.
Chuyển bản thạch vào bể điện di (4.2.4), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.
CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất)3).
6.3.5.2 Chạy điện di
Hút 2 μl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.10) vào 8 μl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào cácgiếng trên bản thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di, chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.5) để sosánh kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 μl thang chuẩn ADN (3.2.5) vào một giếng trên bản thạch.
Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.
6.3.5.3 Đọc kết quả
Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc sản phẩm PCR (4.2.5).
Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:
- Đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);
- Đối chứng dương có vạch sáng kích thước 580 bp.
- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.
Với điều kiện phản ứng trên
Mẫu xét nghiệm âm tính khi:
- Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);
Mẫu xét nghiệm dương tính khi:
- Tại giếng của mẫu thử có vạch sáng có kích thước 580 bp.
6.3.6 Giải trình tự gen
Với các mẫu có kết quả PCR dương tính với vi rút Ranavirus, sản phẩm khuếch đại được làm tinh sạch và giải trình tự gen. Vi rút EHNV được định danh trên cơ sở so sánh với các trình tự DNA riêng có sẵn trên GenBank.
6.4.1 Chuẩn bị tế bào một lớp
Chuẩn bị tế bào BF-2 một lớp trên đĩa 24 giếng (4.3.1) hoặc chai nuôi tế bào 25 cm2 (4.3.2), nuôi ở 22 °C khoảng 4 ngày tùy thuộc vào số lượng tế bào ban đầu trước khi thực hiện quá trình phân lập vì rút. Thành phần môi trường phát triển tế bào (xem Phụ lục D2). Khi tế bào phủ đều khoảng 80 % đến 90 %diện tích đáy chai hay giếng nuôi cấy tế bào, môi trường nuôi cấy tế bào trong, màu đỏ cam là đạt yêu cầu.
6.4.2 Môi trường phát triển tế bào
Môi trường phát triển tế bào MEM phải được chuẩn bị trước, lượng môi trường chuẩn bị căn cứ vào số mẫu cần phân lập vi rút.
6.4.3 Chuẩn bị mẫu
Đồng nhất mẫu bệnh phẩm trong môi trường đồng nhất mẫu (xem Phụ lục D1), tạo thành huyễn dịch có độ pha loãng 1/10 (0,1 g/ml)
Pha loãng mẫu bệnh phẩm:
- Ly tâm huyễn dịch mẫu bệnh phẩm (có nồng độ pha loãng 1/10) với gia tốc 2500 g trong 10 min, ở 4°C.
- Tiến hành pha loãng với môi trường đồng nhất mẫu để tạo ra huyễn dịch có nồng độ 1/100.
Bảo quản mẫu và mẫu đã pha loãng ở âm 80 °C.
CHÚ THÍCH: Thực hiện xử lý mẫu trên đá lạnh.
Hệ thống đối chứng:
-Đối chứng âm (đối chứng tế bào); Chỉ gồm tế bào và môi trường đồng nhất mẫu.
6.4.4 Gây nhiễm vi rút từ mẫu trên tế bào một lớp BF-2
Hút bỏ môi trường nuôi cấy tế bào trong đĩa 24 giếng (4.3.1).
Gây nhiễm vi rút ở hai nồng độ (1/10; 1/100) lên tế bào một lớp BF-2 (3.3.2) đã được nuôi trên đĩa 24 giếng (4.3.1). Mỗi nồng độ pha loãng vi rút được đưa vào hai giếng, mỗi giếng là 150 μl. Bổ sung vào mỗi giếng 1,5 ml môi trường phát triển tế bào. Lưu ý thực hiện với giếng chứa đối chứng âm trước, tiếp theo từ giếng có nồng độ vi rút thấp đến nồng độ cao.
Chuyển đĩa 24 giếng cấy vi rút vào tủ ấm (4.3.4) và ủ ở nhiệt độ 22 °C trong 6 ngày.
Sau 72 h gây nhiễm vi rút, theo dõi sự xuất hiện bệnh lý tế bào (CPE) bằng kính hiển vi soi ngược (4.3.5) với vật kính 4 X và 10 X, để phát hiện CPE. Ban đầu, CPE là các điểm phân giải được bao quanh bởi các tế bào hạt, sau đó sự thay đổi này lan rộng rất nhanh trên toàn bộ thảm tế bào, làm thảm tế bào bị tách ra và tan rã.
Theo dõi bệnh tích tế bào đến ngày thứ 6 sau khi gây nhiễm, nếu xuất hiện CPE tiến hành thu dịch tế bào đem ly tâm (4.1.6) với gia tốc từ 2 000 g đến 4 000 g trong 15 min, ở 4 °C, lấy phần dịch trong để định danh vi rút.
Nếu không xuất hiện CPE, đĩa tế bào được làm đông ở âm 20 °C qua đêm, sau đỏ làm tan, lắc nhẹ. Dịch tế bào và tế bào đơn lớp bám ở đáy giếng ở các nồng độ (1/10; 1/100) của cùng một mẫu được thu vào ống ly tâm 15 ml, ly tâm (4.1.6) với gia tốc từ 2000 gđến 4000 g trong 15 min. Sau đó hút phần dịch trong gây nhiễm lại trên tế bào một lớp BF-2 (3.3.2) của đĩa 24 giếng. Có thể gây nhiễm 1 lần đến 2 lần từ dịch tế bào của lần cấy truyền thứ nhất. Nếu không xuất hiện CPE sau 3 lần gây nhiễm mẫu được xác định là âm tính.
6.4.5 Đánh giá kết quả
Kiểm tra hệ thống đối chứng âm (đối chứng tế bào): Tế bào phát triển bình thường.
Mẫu âm tính là mẫu sau 3 lần gây nhiễm không xuất hiện CPE.
Mẫu dương tính là mẫu xuất hiện CPE và có kết quả thử nghiệm dương tính EHNV bằng kỹ thuật PCR.
Cá được xác định mắc bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV ở cá khi có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và:
- Có kết quả dương tính bằng phương pháp PCR với cặp mồi MCP và có kết quả giải trình tự gen để khẳng định kết quả PCR hoặc
- Có kết quả dương tính bằng phương pháp phân lập EHNV từ bệnh phẩm trên môi trường tế bào và có kết quả thử nghiệm dương tính EHNV bằng kỹ thuật PCR.
Thành phần và chuẩn bị thuốc thử
A.1 Dungdịch đệm TAE 1X hoặc TBE 1X
A.1.1 Thành phần
Dung dịch TAE (hoặcTBE) 10X: | 100 ml |
Nước khử ion: | 900 ml |
Tổng:1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X
A.1.2 Chuẩn bị
Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.
Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
A.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)
A.2.1 Thành phần
Natri clorua (NaCl) | 8 g |
Natri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) | 2,9 g |
Kali dihydro photphat (KH2PO4) | 0,2 g |
Kali clorua (KCl) | 0,2 g |
Nước cất | 1000ml |
A.2.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên vào 1000 ml nước cất, khuấy và lắc đều.
Chỉnh pH về trung tính bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.
CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.
B.1. Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506):
- Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống eppendort, thêm 180 μl dung dịch ATL, thêm 20 μl protease K vào, lắc đều bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3);
- Ủở 56 °C qua đêm cho đến khi hoàn toàn đồng nhất (thỉnh thoảng lắc bằng máy lắc trộn vortex trong quá trình ủ). Lắc đều bằng máy lắc trộn vortex;
- Thêm 200 μl dung dịch AL (Lysis buffer). Lẳc đều bằng máy lắc trộn vortex;
- Ủấm ở 56 °C trong 10 min;
- Thêm 200 μl ethanol (từ 96 % đến tuyệt đối) vào ống eppendort. Lắc đều bằng máy lắc trộn vortex;
- Hút huyễn dịch trong ống eppendort, chuyển sang cột lọc có ống thu ở dưới;
- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.6) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;
- Thay ống thu ở dưới cột lọc;
- Thêm 500 μl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột lọc có ống thu ở dưới;
- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.6) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;
- Thay ống thu ở dưới cột lọc;
- Thêm 500 μl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột lọc có ống thu ở dưới;
- Ly tâm bằng máy ly tâm với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;
- Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml;
- Nhỏ 200 μl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;
- Ly tâm bằng máy ly tâm với gia tốc 6 000 g trong 1 min;
- Chuyển ADN đã thu được sang ống eppendort 1,5 ml khác;
- Bảo quản mẫu ADN ở 2 °C đến 8 °C trong vài tuần và âm 20 °C đến âm 80 °C trong thời gian lâu hơn
CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (EHNV) ở cá hồi.
B.2. Tách chiết ADN bằng TACO RNA/DNA extraction Kít
B.2.1 Vật liệu: Bộ kít chiết tách TACO RNA/DNA extraction Kít (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests)
Ethanol tuyệt đối
B.2.2 Chuẩn bị:
- Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml ethanol tuyệt đối
- Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml ethanol tuyệt đối
- Tiến hành theo sơ đồ
Thuốc Thử | Lượng (μl) | Thuốc thử | Lượng (μl) |
| H | G | F | E | D | C | B | A |
Ethanol tuyệt đối | 250 | - | - | ► 1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Dung dịch đệm rửa A | 750 | Hạt từ | 50 | ► 2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Dung dịch đệm rửa A | 750 | - | - | ► 3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Dung dịch đệm rửa B | 750 | - | - | ► 4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Dung dịch đệm rửa B | 750 | - | - | ► 5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Nước đệm | 100 | - | - | ► 6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Ethanol tuyệt đối | 250 | - | - | ► 7 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Dung dịch đệm rửa A | 750 | Hạt từ | 50 | ► 8 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Dung dịch đệm rửa A | 750 | - | - | ► 9 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Dung dịch đệm rửa B | 750 | - | - | ► 10 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Dung dịch đệm rửa B | 750 | - | - | ► 11 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Nước đệm | 100 | - | - | ► 12 |
|
|
|
|
|
|
|
|
B.2.3 Chuẩn bị mẫu:
- Cho 250 μL/mẫu dung dịch đệm vào các ống eppendort.
- Cho 100 μL/mẫu vào ống eppendort chứa dung đệm.
- Lắc bằng máy lắc trộn votex (4.2.3) trong 15 s.
- Ly tâm 12000 g trong 1 min
- Cho 350 μL (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.
B.2.4 Đưa mẫu vào máy TACO
- Đặt đĩa vào máy TACO
- Đặt lược vào máy TACO.
- Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách trong khoảng 50 min
- Thu 100 μL ADN từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendort mới.
CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV ở cá hồi.
Phương pháp PCR phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do EHNV ở cá
C.1 Trình tự cặp mồi
- Sản phẩm khuếch đại từ xét nghiệm PCR sử dụng cặp mồi MCP phát hiện ranavirus từ cá rô châu Âu, cá hồi vân, cá da trơn, cá Poecilia reticulata (bảy màu cá), cá Labroides dimidatus và các loài ranavirus ở động vật lưỡng cư.
Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi [2]
Cặp mồi | Trình tự mồi từ đầu 5'tới 3' | Kích thước sản phẩm(bp) | |
MCP | EHNV-6R | AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C | 580 |
EHNV-5 | CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT | ||
C.2 Thực hiện phản ứng PCR
Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng: sử dụng cặp mồi EHNV-6R/ EHNV-5 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: Kít Thermo Scienetific Dream Taq PCR Master Mix(2X), Cat. No: K 10714)và hướng dẫn của nhà sản xuất (3.2.1) Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng C.2).
Bảng C.2 - Thành phần phản ứng PCR
Thành phần | Nồng độ (μM) | Thể tích cho 1 phản ứng (μl) |
Nước không có ARN/ADN |
| 6,5 |
Dung dịch Master Mix 2X |
| 12,5 |
Mồi xuôi | 20 | 0,5 |
Mồi ngược | 20 | 0,5 |
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng | 20 | |
Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.
Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng chuẩn.
Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease.
Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng.
Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).
Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Nhiệt độ (°C) | Thời gian | Số chu kỳ (vòng) |
95 | 02 min | 1 |
95 | 30 s | 35 |
55 | 30 s | |
72 | 60s | |
72 | 10 min | 1 |
CHÚ Ý:
+ Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen) và mẫu kiểm chứng âm (mẫu chiết tách và mẫu chạy nhân gen);
+ Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng;
+ Tùy theo kít sử dụng mà thành phần hỗn hợp phản ứng có thể khác nhau, việc thực hiện chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử dụng.
Môi trường phát triển tế bào BF-2
D.1 Môi trường đồng nhất mẫu
- Môi trường: MEM (Earles) (3.3.1);
- Kháng sinh: 200 lU/ml penicillin (3.3.3);
- Kháng sinh: 200 μg/ml streptomycin (3.3.4);
- Kháng sinh: 4 μg/ml amphotericin B (3.3.5);
D.2 Môi trường phát triển tế bào
- Môi trường: MEM (Earles) (3.3.1);
- Kháng sinh: 100 lU/ml penicillin (3.3.3);
- Kháng sinh: 100 μg/ml streptomycin (3.3.4);
- Kháng sinh: 2 μg/ml amphotericin B (3.3.5);
- Huyết thanh thai bê: FBS 10 % thể tích (3.3.6);
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] A. D. Hyatt1, A. R. Gould1, Z. Zupanovic, A. A. Cunningham, S. Hengstberger, R. J. Whittington, J. Kattenbelt, and B. E. H. Coupar, Comparative studies of piscine and amphibian iridoviruses, Arch Virol (2000) 145: 301-331;
[2] OIE/WOAH, 2021, Chapter 2.3.1 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animal, Infection with Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus;
[3] Epizootic Hematopoietic Necrosis Epizootic Haematopoietic Necrosis Last Updated: July 2007, The Center for Food Security & Public Health (CFSPH);
[4] FAO/NACA. 2001. Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fish. Pap. No.402/2;
1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
3) Thông tin này đưa ra tạo đều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
4) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.