Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13613:2022 về Phân bón - Phương pháp định lượng Trichoderma SPP. - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13613:2022

PHÂN BÓN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRICHODERMA SPP. - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

Fertilizers - Horizontal method for the enumeration of Trichoderma spp. - Colony count technique

Lời nói đầu

TCVN 13613:2022 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

PHÂN BÓN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRICHODERMA SPP. - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

Fertilizers - Horizontal method for the enumeration of Trichoderma spp. - Colony count technique

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Trichoderma spp, trong phân bón hay nguyên liệu sản xuất phân bón bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 with amendment 1:2013), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

3  Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau:

3.1

Môi trường chọn lọc Trichoderma (Trichoderma selective medium TSM)

Môi trường dinh dưỡng đặc biệt, ưu tiên sự phát triển của Trichoderma spp. và ức chế hoàn toàn hoặc một phần các nhóm vi sinh vật khác.

3.2

Trichoderma spp. (Trichoderma spp.)

Loại nấm hiếu khí, sống trong đất ở vùng rễ cây trồng; có khả năng phân giải xenlulo và/hoặc đối kháng vi khuẩn/nấm gây bệnh cây trồng, ...; là thành phần của phân bón hoặc nguyên liệu sản xuất phân bón;

Hình thành khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường TSM (Trichoderma selective medium); có các đặc điểm về khuẩn lạc, sợi nấm và bào tử nấm được mô tả khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

3.3

Định lượng Trichoderma spp. (Trichoderma spp. enumeration)

Việc xác định số lượng Trichoderma spp. (3.2) trong một khối lượng hoặc thể tích cụ thể của phân bón, nguyên liệu sản xuất phân bón khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

4  Nguyên tắc

Định lượng Trichoderma spp. trong phân bón, nguyên liệu sản xuất phân bón bằng phương pháp đếm số lượng đơn vị khuẩn lạc đặc trưng phát triển trên môi trường TSM (Trichoderma selective medium) và được khẳng định thông qua đặc điểm khuẩn lạc, sợi nấm, bào tử nấm dưới kính hiển vi quang học.

5  Môi trường và thuốc thử

5.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy theo TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014).

Ưu tiên sử dụng các thành phần cơ bản khô, hoặc các môi trường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị môi trường, thuốc thử; thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Các hóa chất sử dụng phải đạt chất lượng phân tích và thích hợp để phân tích vi sinh vật.

Nước sử dụng phải là nước cất hoặc có chất lượng tương đương [xem TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 with amendment 1:2013)].

5.2  Môi trường TSM (Trichoderma selective medium)

5.2.1  Thành phần

Hỗn hợp I:

5.2.2  Chuẩn bị

Chuẩn bị hỗn hợp I: Cân và hòa tan các thành phần trong nước cất theo thứ tự đã liệt kê tại (5.2.1). Phân phối hỗn hợp I với lượng thích hợp vào các bình thủy tinh (6.2.1). Không vặn chặt nắp bình thủy tinh. Khử trùng 15 min, trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C;

Chuẩn bị hỗn hợp II: Hòa tan các thành phần trong nước cất khử trùng theo thứ tự đã liệt kê tại (5.2.1); Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy vô trùng (6.1.1);

Sau khi khử trùng hỗn hợp I, làm nguội đến 44 °C - 47 °C. Trộn đều hỗn hợp II vào hỗn hợp I thu được môi trường TSM. Phân phối lượng khoảng từ 18 mL đến 20 mL môi trường TSM vào các đĩa Petri (6.2.7) đã được chuẩn bị như nêu tại 8.1.1 và để cho đông đặc. Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy vô trùng (6.1.1);

Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng (đảm bảo không có các giọt nước trên bề mặt môi trường) bằng cách lật úp các đĩa thạch và để trong tủ ấm (6.1.4) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 35 °C trong 25 min đến 30 min hoặc để qua đêm.

5.3  Môi trường PDA (Potato Detrose Agar)

5.3.1  Thành phần

Chuẩn bị nước chiết khoai tây: Lấy 200,0 g khoai tây gọt vỏ, thái nhỏ; cho vào 500 mL nước cất, đun sôi trong 20 min; sau đó lọc lấy nước trong; thêm nước cất đến 1 000 mL.

5.3.2  Chuẩn bị

Cân và hòa tan các thành phần trong nước theo thứ tự đã liệt kê tại (5.3.1).

Phân phối môi trường PDA với lượng thích hợp vào các bình thủy tinh (6.2.1). Không vặn chặt nắp bình thủy tinh. Khử trùng 15 min, trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C;

Sau khi khử trùng, làm nguội đến 44 °C - 47 °C. Phân phối lượng khoảng từ 18 mL đến 20 mL môi trường PDA vào các đĩa Petri (6.2.7) đã được chuẩn bị như nêu tại 8.1.1 và để cho đông đặc. Các thao tác tiến hành trong tủ cấy vô trùng (6.1.1);

Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng (đảm bảo không có các giọt nước trên bề mặt môi trường) bằng cách lật úp các đĩa thạch và để trong tủ ấm (6.1.4) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 35 °C trong 25 min đến 30 min hoặc để qua đêm.

5.4  Thuốc nhuộm LPCB (Lactophenol cotton blue)

5.4.1  Thành phần

5.4.2  Chuẩn bị

Cho nước cất vào cốc thủy tinh (6.2.2), thêm cotton blue và khuấy đều; để yên trong 8 h đến 10 h; lọc qua phễu lọc (6.2.10) đề loại bỏ cặn không hòa tan, thu được hỗn hợp (a);

Cho axít lactic vào cốc thủy tinh (6.2.2), thêm phenol tinh thể và khuấy đều. Tiếp tục thêm glycerin, khuấy đều, thu được hỗn hợp (b);

Trộn đều hỗn hợp (a) và hỗn hợp (b), thu được thuốc nhuộm LPCB.

Bảo quản trong lọ sẫm màu, đậy kín, bảo quản ở nhiệt độ phòng, thời hạn sử dụng 1 tháng.

CHÚ THÍCH 1: Sử dụng găng tay khi chuẩn bị thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue.

5.5  Dung dịch pha loãng (dung dịch muối pepton)

5.5.1  Thành phần

5.5.2  Chuẩn bị

Cân và hòa tan các thành phần trong nước cất theo thứ tự đã liệt kê tại (5.5.1), đun nóng, nếu cần. Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, dung dịch có pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần;

Phân phối dung dịch pha loãng với lượng cần thiết vào các bình thủy tinh (6.2.1) có dung tích thích hợp sao cho sau khi khử trùng trong mỗi bình thủy tinh chứa 90,0 mL. Sai số cho phép đo của thể tích cuối cùng sau khi khử trùng không được vượt quá ± 0,2 %;

Phân phối dung dịch pha loãng với lượng cần thiết để chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân vào các ống nghiệm (6.2.3) sao cho sau khi khử trùng trong mỗi ống nghiệm chứa 9,0 mL. Sai số cho phép đo của thể tích cuối cùng sau khi khử trùng không được vượt quá ± 0,2 %;

Đậy nắp bình thủy tinh hoặc ống nghiệm; Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C.

5.6  Dung dịch Tween 80 (C₆₄H₁₂₄O₂₆)

Dung dịch Tween 80 được khử trùng 15 min, trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C;

6  Thiết bị, dụng cụ

Có thể sử dụng các dụng cụ dùng một lần thay cho các dụng cụ sử dụng nhiều lần nếu các thông số kỹ thuật tương tự.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 with amendment 1:2013)] và cụ thể như sau:

6.1  Thiết bị

6.1.1  Tủ cấy vô trùng (Box cấy), đạt an toàn sinh học cấp 2, luồng không khí thổi theo chiều dọc.

6.1.2  Nồi hấp áp lực, có nhiệt độ hơi nước bão hòa trong buồng có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 °C ± 3 °C tương ứng áp suất tối thiểu 101,3 kPa.

6.1.3  Tủ sấy, thông gió đối lưu, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 160 °C đến 180 °C, độ chính xác đến 1 °C.

6.1.4  Tủ ấm, thông gió đối lưu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 35 °C, độ chính xác đến 1 °C.

6.1.5  Máy lắc, tốc độ đạt 150 r/min.

6.1.6  Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.

6.1.7  Máy trộn Vortex, tốc độ lắc đạt 1 000 r/min, lắc tròn.

6.1.8  Kính hiển vi quang học, có độ phóng đại đến 1 000 X, sử dụng vật kinh soi dầu.

6.1.9  Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.

6.2  Dụng cụ

6.2.1  Bình thủy tinh có nắp vặn, có dung tích thích hợp.

6.2.2  Cốc thủy tinh, có dung tích thích hợp.

6.2.3  Ống nghiệm có nắp vặn, có dung tích thích hợp.

6.2.4  Que cấy móc, đầu que cấy bằng chất liệu Volfram.

6.2.5  Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo hoặc bằng thép.

6.2.6  Micropipet, có dung tích danh định 10 mL, 1 mL, 0,1 mL; sử dụng đầu tip vô trùng.

6.2.7  Đĩa Petri, đường kính 90 mm.

6.2.8  Lam kính, bằng thủy tinh.

6.2.9  Lamen, bằng thủy tinh.

6.2.10  Phễu lọc, có màng lọc vô trùng, cỡ lỗ 0,45 μm.

7  Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu, nên lấy mẫu theo TCVN 12105:2018.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

8  Cách tiến hành

8.1  Chuẩn bị

8.1.1  Dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được khử trùng bằng 1 trong 2 cách sau:

- tiệt trùng khô ở nhiệt độ (170 + 10)°C không ít hơn 1 h trong tủ sấy (6.1.3) hoặc;

- tiệt trùng hơi nước ở nhiệt độ (121 ± 3) °C không ít hơn 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2).

8.1.2  Chuẩn bị mẫu

Dùng cân kỹ thuật (6.1.6) cân 10 g mẫu hoặc dùng micropipet với đầu tip vô trùng (6.2.6) hút 10 mL mẫu cho vào bình thủy tinh (6.2.1) chứa 90 mL dung dịch pha loãng đã chuẩn bị như nêu tại (5.5); Bổ sung 0,1 mL dung dịch Tween 80 đã chuẩn bị đã chuẩn bị như nêu tại (5,6). Tránh chạm micropipet vào dung dịch pha loãng. Lắc trên máy lắc (6.1.5) từ 5 min đến 10 min sao cho vi sinh vật trong dung dịch phân bố đồng đều. Để cho các phần từ nặng lắng xuống trong thời gian không nhiều hơn 3 min, nếu cần. Dung dịch phía trên được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu;

Dùng micropipet với đầu típ vô trùng (6.2.6) hút 1 mL dịch huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm (6.2.3) chứa 9 mL dung dịch pha loãng đã chuẩn bị đã chuẩn bị như nêu tại (5.5). Tránh chạm đầu típ vào dung dịch pha loãng. Trộn kỹ trên máy trộn Vortex (6.1.7) từ 5 s đến 10 s để có dung dịch mẫu, nồng độ 10^-2. Lấy dung dịch mẫu, nồng độ 10^-2 pha loãng 10 lần để thu được dung dịch mẫu, nồng độ 10-3. Lặp lại qui trình để thu được dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng thập phân tiếp theo. Thường sử dụng nồng độ pha loãng 10^-5, 10^-6, 10^-7 đối với phân bón vi sinh và nồng độ pha loãng 10^-3, 10^-4, 10^-5 đối với các phân bón khác có chứa vi sinh vật.

CHÚ THÍCH 2: Hoạt hóa mẫu (nếu có) theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo kết quả chính xác.

8.2  Cấy và ủ

Dùng micropipet với đầu típ vô trùng (6.2.6) lấy 0,1 mL dung dịch mẫu cho vào mỗi đĩa Petri chứa môi trường TSM đã chuẩn bị đã chuẩn bị như nêu tại (5.2). Lặp lại qui trình với các dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng thập phân tiếp theo; mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa Petri;

Dùng que dàn mẫu (6.2.5) dàn đều dịch cáy trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt mà không chạm vào thành đĩa Petri. Sử dụng một que dàn mẫu vô trùng cho mỗi đĩa Petri. Đậy nắp dĩa Petri và để yên trong khoảng 15 min ở nhiệt độ phòng đẻ dịch cấy hấp thụ vào bề mặt thạch.

Nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở (28 ± 1) °C trong 5 ngày đến 7 ngày.

8.3  Đếm khuẩn lạc

Đếm các khuẩn lạc Trichoderma spp. giả định ở hai độ pha loãng liên tiếp, trên các dĩa Petri có chứa không nhiều hơn 150 khuẩn lạc.

Trên môi trường TSM, khuẩn lạc Trichoderma spp. giả định có dạng cụm, bông (floccose) hay mọc thành búi (tufted), sợi nấm được hình thành ở dạng gần như vòng tròn đồng tâm; ở giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy có màu trắng, sau chuyển dần sang màu xanh lá hoặc xanh lục hoặc xanh vàng (xem Hình 1).

Khuẩn lạc Trichoderma spp. giả định được khẳng định thông qua phép thử khẳng định.

Hình 1. Khuẩn lạc Trichoderma spp. trên môi trường TSM sau 5 ngày ủ (A), sau 7 ngày ủ (B)

CHÚ THÍCH 3: Trên môi trường TSM, một số loại nấm mốc như Aspergillus spp., Penicillium spp. cũng có thể phát triển. Các khuẩn lạc này có thể nhận diện và loại trừ bằng cách quan sát màu sắc sợi nấm; đặc điểm hình thái sợi nấm, cuống sinh bào tử và bào tử trên kính hiển vi.

8.4  Phép thử khẳng định

Từ mỗi đĩa Petri đã chọn (8.3), lấy năm khuẩn lạc Trichoderma spp. giả định để thực hiện phép thử khẳng định. Nếu trên đĩa Petri có ít hơn năm khuẩn lạc, thì lấy tất cả các khuẩn lạc có mặt;

Dùng que cấy móc (6.2.4), lấy sinh khối vi sinh vật từ các khuẩn lạc Trichoderma spp. giả định được lựa chọn cấy trên thạch đĩa Petri chứa môi trường PDA (5.3), nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở (28 ± 1) °C từ 2 ngày đến 7 ngày;

Làm tiêu bản để quan sát sợi nấm và bào tử nấm: Dùng dao lam cắt miếng thạch trên đĩa Petri đã nuôi cấy khuẩn lạc được lựa chọn, kích thước 0,5 x 0,5 cm, đặt lên lam kính (6.2.8). Nhỏ 0,03 mL thuốc nhuộm LPCB (5.4) lên sợi nấm, giữ trong 30 min. Dùng lamen (6.2.9) đậy lên bề mặt, tránh làm bọt khí;

Soi tiêu bản trên kính hiển vi quang học (6.1.8), đánh giá đặc điểm khuẩn lạc, sợi nấm và bào tử nấm Trichoderma (xem Phụ lục A);

9  Tính và biểu thị kết quả

Số lượng khuẩn lạc Trichoderma spp. trên mỗi đĩa Petri theo các tiêu chí xác định được tính theo công thức (1):

Trong đó

b  số lượng khuẩn lạc Trichoderma spp. giả định cho thấy có đặc điểm như phép thử khẳng định của tiêu chuẩn;

A  số lượng khuẩn lạc Trichoderma spp. giả định đã qua phép thử khẳng định;

C tổng số khuẩn lạc Trichoderma spp. giả định đếm được trên đĩa Petri.

Làm tròn kết quả tính được đến số nguyên gần nhất.

Số lượng Trichoderma spp. trong một đơn vị kiểm tra được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên gam hay mililit, theo công thức (2):

trong đó:

Làm tròn kết quả tính được đến một chữ số sau dấu phẩy. Biểu thị kết quả bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10^x, trong đó x là số mũ của 10.

Biểu thị kết quả trong trường hợp số đếm thấp hoặc trường hợp đặc biệt theo quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218).

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử nghiệm đã dùng hoặc viện dẫn tiêu chuẩn này;

- các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Quy định)

Đặc điểm khuẩn lạc, sợi nấm và bào tử nấm Trichoderma spp. nuôi cấy trên môi trường PDA

Khuẩn lạc nấm Trichoderma spp. có dạng cụm, bông (floccose) hay mọc thành búi (tufted), sợi nấm hình thành ở dạng gần như vòng tròn đồng tâm. Ở giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy có màu trắng, sau chuyển dần sang màu xanh lá hoặc xanh lục hoặc xanh vàng; tiết sắc tố màu trắng nhạt, nâu hoặc hơi vàng trên mòi trường thạch đĩa Petri.

Sợi nấm Trichoderma spp. phân nhánh mạnh, các nhánh sợi nấm thường mọc tạo góc với trục chính khoảng 90°.

Cuống đính bào tử phân nhánh, thường phình rộng ở giữa giống như hình cái bình hoặc hình trụ hoặc hình trứng.

Thể bình (phialide) thường mọc đối xứng hai bên, vuông góc và ngay sát gốc cuống sinh bào tử; phình to ở giữa, thót nhọn ở phần ngọn;

Bào tử có hình dạng điển hình sau 5-7 ngày nuôi cấy. Bào tử đính (conidia) có hình ovan (kích thước 3 - 5 x 2 - 4 μm, chiều dài / chiều rộng ≥ 1,3) hoặc trứng (chiều dài / chiều rộng < 1,3); màu xanh lục, đính trên những sợi nấm; bề mặt thường nhẵn, ít loài có bề mặt bào tử đính gồ ghề (như T.viride).

Hệ sợi nấm hình thành thêm bào tử hậu (Chlamydospore), thường được tìm thấy dưới dạng các tế bào sinh dưỡng có vách dày. Các bào tử hậu ở dạng đơn bào, hình tròn hoặc hình trứng, được hình thành trong sợi nấm hoặc ở đầu sợi nấm.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Hình ảnh khuẩn lạc, sợi nấm và bào tử của một số loài thuộc chi Trichoderma nuôi cấy trên môi trường PDA

B.1  Tricboderma asperellum (xem Hình B.1)

Hình B.1. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma asperellum trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy. B. Cành bào tử phân sinh (Mũi tên số 1), thể bình (Mũi tên số 2) và bào tử (Mũi tên số 3); Thanh bar: 10 μm.

B.2  Trichoderma hamatum (xem Hình B.2)

Hình B.2. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma hamatum Tri 78 trên môi trường PDA sau 6 ngày nuôi cấy. B. Cành bào tử phân sinh (Mũi tên số 1), thể bình (Mũi tên số 2) và bào tử phân sinh (Mũi tên số 3); Thanh bar: 10 μm.

B.3  Trichoderma harzianum (xem Hình B.3)

Hình B.3. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma harzianum trên môi trường PDA sau 6 ngày nuôi cấy. B. Cuống bào tử (Mũi tên số 1), Thể bình (Mũi tên số 2), C. Bào tử (Mũi tên số 3); Thanh bar: 10 μm.

B.4  Trichoderma koningii (xem Hình B.4)

Hình B.4. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma koningii trên môi trường PDA sau 6 ngày nuôi cấy. B. Cành bào tử phân sinh (Mũi tên số 1), thể bình (Mũi tên số 2) và bào tử phân sinh (Mũi tên số 3); Thanh bar: 10 μm.

B.5  Trichoderma longibrachiatum (xem Hình B.5)

Hình B.5. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma longibrachiatum UENF-F476 trên môi trường PDA sau 7 ngày nuôi cấy. B. Cành bào tử (Mũi tên số 1), Bào tử (Mũi tên số 2). Thanh bar: 20 μm.

B.6  Trichoderma pseudokoningii (xem Hình B.6)

Hình B.6. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma pseudokoningii trên môi trường PDA sau 4 ngày nuôi cấy. B. Thể bình (Mũi tên số 1), Cuống bào tử (Mũi tên số 2), Bào tử (Mũi tên số 3)

B.7  Trichoderma reesei (xem Hình B.7)

Hình B.7. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma reesei T-GL6 trên môi trường PDA sau 6 ngày nuôi cấy. B. Cuống bào tử (Mũi tên số 1), Bào tử (Mũi tên số 2), Túi bào tử (Mũi tên số 3
Thanh bar: 10 μm.

B.8  Trichoderma virens (xem Hình B.8)

Hình B.8. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma virens trên môi trường PDA sau 6 ngày nuôi cấy. B. Bào tử (Mũi tên số 1), C. Thể bình (Mũi tên số 2), D. Cuống bào tử (Mũi tên số 3). Thanh bar: 50 gm (B); 20 μm (C,D)

B.9  Trichoderma viride (xem Hình B.9)

Hình B.9. A. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma viride trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy. B. Thể bình (Mũi tên số 1), Cuống bào tử (Mũi tên số 2), Bào tử (Mũi tên số 3), Túi Bào tử (Mũi tên số 4).

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6507-1:2019. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân.

[2] TCVN 12105:2018. Phân bón vi sinh vật - Lấy mẫu.

[3] Chandra Sekhar Y., Khayum Ahmmed S., Prasad T. N. V.K.V. and Sarada Jayalakshmi Devi R. (2017). Identification of Trichoderma species based on morphological characters isolated from rhizosphere of groundnut (Arachis hypogaea L).

[4] Elad Y., I Chet, I. Hennis (1981). A selective media for improving quantitative isolation of Trichoderma from soil.

[5] Gary J. Samuels and Prakash K. Hebbar (2015). Trichoderma - Identification and agricultural application.