Pesticides - Part 4: Determination of cytokinins group content by high performance liquid chromatographic method
Lời nói đầu
TCVN 13262-4: 2020 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT – PHẦN 4: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT NHÓM CYTOKININS BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Pesticides - Part 4: Determination of cytokinins group content by high performance liquid chromatographic method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất nhóm cytokinins (cytokinin) gồm (zeatin, zeatin riboside, kinetin và benzylaminopurine) trong thuốc bảo vệ thực vật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Thông tin giới thiệu hoạt chất nhóm cytokinins xem Phụ lục A.
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử
Cytokinins tổng số được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng cột pha đảo (C18) với detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,... hoặc tương đương), ở bước sóng 270 nm. Kết quả định danh được xác định dựa trên sự so sánh giữa thời gian lưu của píc mẫu thử và píc chuẩn. Kết quả định lượng được xác định dựa trên đường chuẩn.
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, nước dùng trong quá trình phân tích đạt loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc có độ tinh khiết tương đương, sau đây gọi là nước.
4.1 Chất chuẩn zeatin, đã biết hàm lượng, được chứng nhận.
4.2 Chất chuẩn zeatin riboside, đã biết hàm lượng, được chứng nhận.
4.3 Chất chuẩn kinetin, đã biết hàm lượng, được chứng nhận.
4.4 Chất chuẩn benzylaminopurine, đã biết hàm lượng, được chứng nhận.
4.5 Acetonitrile (C2H3N), dùng cho sắc ký lỏng.
4.6 Metanol (CH4O), dùng cho sắc ký lỏng.
4.7 Axit axetic băng (C2H4O2), dùng cho sắc ký lỏng.
4.8 Dung dịch axetic, 0,1 % theo thể tích
Dùng pipet (5.3) lấy 1 ml axit axetic băng (4.7) cho vào cốc dung tích 1000 ml (5.1) có chứa sẵn 1000 ml nước cất. Siêu âm 10 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
4.9 Kali hidroxit (KOH), tinh khiết phân tích.
4.10 Dung dịch kali hidroxit (KOH), nồng độ khoảng 0,05M.
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,28 gram kali hidroxit (4.9) chính xác đến 0,0001 g vào bình định mức dung tích 100 ml (5.2), hòa tan và định mức tới vạch bằng nước.
4.11 Dung dịch chuẩn gốc
4.11.1 Dung dịch chuẩn gốc zeatin, nồng độ khoảng 1000 mg/l
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g chất chuẩn cytokinin zeatin, chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
4.11.2 Dung dịch chuẩn gốc zeatin riboside, nồng độ khoảng 1000 mg/l
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g chất chuẩn cytokinin zeatin riboside (4.2), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
4.11.3 Dung dịch chuẩn gốc kinetin, nồng độ khoảng 1000 mg/l
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g chất chuẩn cytokinin kinetin (4.3), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
4.11.4 Dung dịch chuẩn gốc benzylaminopurine, nồng độ khoảng 1000 mg/l
Dùng cân phân tích (5.7) cân khoảng 0,01 g chất chuẩn cytokinin benzylaminopurine (4.4), chính xác đến 0,00001 g vào bình định mức 10 ml (5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
4.12 Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian, nồng độ khoảng 100 mg/l
Dùng pipet (5.3) hút 2 ml các dung dịch chuẩn gốc (4.11) vào bình định mức 20 ml (5.2), hòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 1 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
4.13 Dãy dung dịch chuẩn làm việc, nồng độ khoảng 1; 2; 4; 6; 8 mg/l
Dùng pipet (5.3) lấy chính xác 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.12) vào lần lượt 5 bình định mức dung tích 10 ml ( 5.2), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10) định mức đến vạch bằng metanol (4.6), siêu âm trong 1 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.
CHÚ THÍCH:
1) Chất chuẩn bảo quản trong tủ mát ở 4 °C ± 2 °C;
2) Nếu sử dụng cân có cấp chính xác 0,0001 g thì lượng mẫu và chuẩn tăng lên 10 lần;
3) Dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn trung gian nên bảo quản ở 4 °C ± 2 °C, nên sử dụng trong vòng 1 tháng kể từ ngày pha;
4) Dung dịch chuẩn phải kiểm tra chất lượng trước khi sử dụng.
5) Dung dịch chuẩn làm việc nên sử dụng ngay sau khi pha từ dung dịch chuẩn trung gian.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm cụ thể như sau:
5.1 Cốc thủy tinh, dung tích 50ml; 100ml; 1000 ml.
5.2 Bình định mức, dung tích 10 ml; 20 ml; 50 ml; 100 ml.
5.3 Pipet chia vạch, dung tích 0,5 ml; 1 ml; 2 ml; 5 ml; 10 ml.
5.4 Xyranh bơm mẫu, dung tích 50 μl, chia vạch đến 1 μl. hoặc bơm mẫu tự động
5.5 Màng lọc xyranh PTFE, có kích thước lỗ 0,45 μm, đường kính 25 mm.
5.6 Bể siêu âm, tần số siêu âm từ 40 kHz đến 100 kHz.
5.7 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,00001 g và 0,0001 g.
5.8 Xyranh lọc mẫu, dung tích 1 ml dùng cho màng lọc xyranh PTFE (5.5)
5.9 Sàng rây, đường kính lỗ 0,2 mm
5.10 Bộ lọc dung môi, màng lọc PTFE có kích thước lỗ 0,45 μm.
5.11 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, được trang bị như sau:
- Detector tử ngoại (DAD, MWD, PDA,... hoặc tương đương);
- Hệ thống bơm cao áp;
- Buồng điều nhiệt cột tách;
- Máy tích phân hoặc máy vi tính;
- Cột RP C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, cỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương;
- Bộ bơm mẫu tự động hoặc bơm mẫu bằng tay.
6.1 Lấy mẫu
Tiêu chuẩn này không qui định việc lấy mẫu.
Nên lấy mẫu theo TCVN 12017 : 2017
6.2 Chuẩn bị mẫu
Mẫu cần được làm đồng nhất trước khi cân: Đối với mẫu dạng lỏng phải lắc đều, nếu bị đông đặc do nhiệt độ thấp cần được làm tan chảy ở nhiệt độ (30 ± 2) °C; đối với mẫu dạng bột phải được trộn đều; đối với mẫu dạng hạt thì phải nghiền mịn và rây qua rây có đường kính lỗ 0,2 mm, trộn đều làm mẫu phân tích.
7.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
Dùng cân phân tích (5.7) cân 2 phần mẫu thử mỗi phần khoảng 1 g, chính xác đến 0,0001 g vào cốc dung tích 50 ml (5.1), thêm 1 ml dung dịch kali hidroxit 0,05M (4.10), 10 ml metanol (4.6). Đặt vào bể siêu âm (5.6), siêu âm 5 min, để nguội đến nhiệt độ phòng. Chuyển toàn bộ vào bình định mức 20 ml (5.2), tráng rửa 2 lần mỗi lần 3 ml methanol (4.6). Định mức đến vạch bằng metanol (4.6), lọc qua màng lọc xyranh 0,45 μm (5.5) trước khi bơm vào thiết bị.
7.2 Điều kiện phân tích
Các điều kiện vận hành sắc ký sau đây được cho là thích hợp:
Tỷ lệ pha động:
|
t (min) |
Metanol (4.6) (% theo thể tích) |
Dung dịch axit axetic (4.8) (% theo thể tích) |
|
0 |
35 |
65 |
|
15 |
55 |
45 |
|
16 |
35 |
65 |
|
Cột phân tích: |
Cột RP C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, cỡ hạt pha tĩnh 5 μm hoặc loại tương đương |
|
Bước sóng: |
270 nm |
|
Tốc độ dòng: |
1 ml/min |
|
Thể tích bơm mẫu: |
20 μl |
|
Nhiệt độ buồng cột: |
25 °C |
|
Thời gian phân tích: |
20 min |
7.3 Dựng đường chuẩn
Dựng đường chuẩn (tương quan giữa diện tích píc và nồng độ chất chuẩn) của một hoạt chất tại 5 điểm có nồng độ tương ứng dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.13).
7.4 Xác định
Dùng xyranh (5.4) bơm điểm nồng độ thấp nhất trong dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.13) cho đến khi số đo diện tích của pic chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 %. Sau đó, bơm lần lượt dung dịch chuẩn làm việc từ nồng độ thấp đến cao (4.13) và dung dịch mẫu thử (7.1), lặp lại 2 lần (số đo diện tích của pic chuẩn thay đổi không lớn hơn 3 % so với giá trị ban đầu). Nếu nồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử bằng metanol (4.6).
Hàm lượng hoạt chất cytokinins trong mẫu là tổng hàm lượng các loại cytokinins được quy định trong mục 1, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức:
trong đó:
X0i là nồng độ của cytokinin thứ i trong mẫu tính theo đường chuẩn, tính bằng miligam trên lít (mg/l);
V là thể tích dung môi chiết mẫu mililit (ml)
m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g)
Pi là độ tinh khiết của chất chuẩn cytokinin thứ i
Kết quả thử nghiệm thu được, lấy hai chữ số sau dấu phẩy.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
Giới thiệu hoạt chất nhóm cytokinins
A.1 Giới thiệu hoạt chất cytokinin zeatin
- Công thức cấu tạo:
- Tên hoạt chất: cytokinin zeatin
- Tên hóa học: IUPAC: (E)-2-methyl-4-(7H-purin-6-ylamino)but-2-en-1-ol
- Công thức phân tử: C10H13N5O
- Khối lượng phân tử: 219,248 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 208 °C đến 210 °C
- Độ hòa tan: Tan tốt trong dung môi hữu cơ
- Dạng bên ngoài: Chất rắn, màu trắng đến vàng
A.2 Giới thiệu hoạt chất cytokinin zeatin riboside
- Công thức cấu tạo:
- Tên hoạt chất: zeatin riboside
- Tên hóa học: 6-[(E)-4-Hydroxy-3-methylbut-2-enylamino]-9-β-D-ribofuranosylpurine
- Công thức phân tử: C15H21N5O5
- Khối lượng phân tử: 351,37
A.3 Giới thiệu hoạt chất cytokinin kinetin
- Công thức cấu tạo:
- Tên hoạt chất: cytokinin kinetin
- Tên hóa học: IUPAC: N6-furfuryladenine
- Công thức phân tử: C10H9N5O
- Khối lượng phân tử: 215,56
- Nhiệt độ nóng chảy: 269 °C đến 271 °C 12
A.4 Giới thiệu hoạt chất cytokinin benzylaminopurine
- Công thức cấu tạo:
- Tên hoạt chất: cytokinin benzylaminopurine
- Tên hóa học: IUPAC: N-(Phenylmethyl)-7H-purin-6-amine
- Công thức phân tử: C12H11N5
- Khối lượng phân tử: 225,25
A.5 Hiệu suất thu hồi và giới hạn định lượng
- Hiệu suất thu hồi của phương pháp: từ 80 % đến 110 %.
- Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ):
- Zeatin: 5 mg/kg
- Zeatin riboside: 5 mg/kg
- Kinetin: 5 mg/kg
- Benzylaminopurine: 2,5 mg/kg
- Độ lặp lại của phương pháp, CV ≤ 7 %.
Thông tin về sắc ký đồ điển hình của nhóm cytokinins
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 12017: 2017 Thuốc bảo vệ thực vật- Lấy mẫu
[2] Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam.
[3] Manual pesticides
[4] Analysis of cytokinins by immunoassay and high performance liquid chromatography of in vitro cultivated dianthus caryophyllus, bulg.J.PIant physiol., 1996, 22(3-4), 95-104
[5] New Methods of Qualitative and Quantitative Analysis of Cytokinins, Michal Karády
[6] Analytical methods for cytokinins, Petr Tarkowski, Liya Ge, Jean Wan Hong Yong, Swee Ngin Tan, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 28, No. 3, 2009