Biofertilizers - The determination of endomycorrhizae density - Part 1: Counting the number of endomycorrhizae spores with the wet sieving technique in combination with flotation centrifugation
Lời nói đầu
TCVN 12560-1:2018do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
PHÂN BÓN VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH - PHẦN 1: ĐẾM SỐ LƯỢNG BÀO TỬ NẤM NỘI CỘNG SINH BẰNG KỸ THUẬT SÀNG ƯỚT,LY TÂM NỔI
Biofertilizers - The determination of endomycorrhizae density - Part 1: Counting the number of endomycorrhizae spores with the wet sieving technique in combination with flotation centrifugation
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định mật độ bào tử nấm rễ nội cộng sinh có hoạt tính (IP) trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật sàng ướt, ly tâm nổi trong dịch chứa sucroza.
Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau:
3.1
Nấm rễ nội cộng sinh (endomycorrhizae hoặc arbuscular mycorrhiza fungi)
Loại nấm cộng sinh với rễ cây trồng, không làm thay đổi hình thái bên ngoài của rễ nhưng giúp tăng cường vận chuyển, hấp thụ các chất dinh dưỡng và nước, kích thích tạo thành nốt sần, cải thiện cấu trúc đất và là một tác nhân trong kiểm soát sinh học.
3.2
Bào tử nấm rễ nội cộng sinh có hoạt tính (viable endomycorrhiza spores)
Hình cầu, hình thoi hoặc dạng khác, kích thước 50 - 500 μm, bắt màu hồng hoặc đỏ khi nhuộm với thuốc nhuộm 2,5-diphenyl-2N-tetrazolium bromide (MTT), được tạo thành từ sợi nấm trong đất hoặc ngoài rễ, mọc đơn lẻ hoặc thành chùm, có khả năng nảy mầm ở điều kiện thích hợp, xâm nhiễm vào rễ cây ký chủ tạo thành các cấu trúc chùm (arbuscular), túi bọt (vesicles), sợi nấm gian bào (intercellular hyphae), sợi nấm nội bào (intracellular hyphae).
Khi sàng ướt qua rây, các bào tử nấm rễ nội cộng sinh và lượng rất nhỏ của mảnh vụn hữu cơ được giữ lại trên bề mặt rây. Ly tâm trong dịch sucroza 50 %, bào tử nấm sẽ nổi lên trên, các mảnh vụn hữu cơ chìm xuống dưới. Cho dịch chứa bào tử qua phễu lọc hút chân không, các bào tử sẽ bị giữ lại trên bề mặt giấy lọc. Nhuộm bào tử thu được với thuốc nhuộm 2,5-diphenyl-2N-tetrazolium bromide (MTT) 0,25 %, các bào tử có hoạt tính (IP) bắt màu hồng hoặc đỏ. Đếm số lượng bào tử có hoạt tính dưới kính hiển vi nổi hoặc hiển vi thường
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết phân tích để pha các loại dung dịch, thuốc thử, chất chuẩn.
5.1 Nước, đáp ứng các yêu cầu của nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3969:1987).
5.2 Dung dịch sucroza 50 %
Cân 500 g sucroza trên cân phân tích (6.2), chính xác đến 0,001 g, cho vào bình định mức dung tích 1000 mL (6.10), thêm nước (5.1) đến vạch định mức, lắc đều.
5.3 Dung dịch 2,5-diphenyl-2N-tetrazolium bromide 0,25 % (MTT 0,25 %)
Cân 0,25 g 2,5-diphenyl-2N-tetrazolium bromide (MTT) trên cân phân tích (6.2), chính xác đến 0,001 g, cho vào bình định mức dung tích 100 mL (6.10), thêm nước (5.1) đến vạch định mức, lắc đều.
CHÚ THÍCH 1: Dung dịch MTT 0,25 % cần được bảo quản trong lọ tối màu, tránh ánh sáng; thời gian bảo quản không nhiều hơn 2 tuần ở nhiệt độ từ 2 đến 8 °C. Không để dung dịch MTT 0,25 % tiếp xúc với da và mắt.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và cụ thể như sau:
6.1 Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ đạt 150 r/min, nhiệt độ từ 20 °C đến 40 °C.
6.2 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,001 g.
6.3 Máy ly tâm, ly tâm được tốc độ 2 000 r/min, có khả năng sử dụng được các ống phancon có nắp, dung tích 10 mL, 25 mL hoặc 50 mL.
6.4 Bơm hút chân không, độ chân không không ít hơn 100 mbar, tốc độ dòng chảy không ít hơn 20 L/min.
6.5 Kính hiển vi soi nổi hoặc kính hiển vi thường, có trường sáng, độ khuếch đại không ít hơn 70 lần.
6.6 Nồi hấp áp lực, áp suất tối thiểu 101,3 kPa, nhiệt độ 121 °C.
6.7 Tủ sấy, có thể kiểm soát nhiệt độ từ 40 °C đến 260 °C.
6.8 Bình tam giác, dung tích 500 mL.
6.9 Cốc, dung tích 50 mL, 250 mL, 1000 mL.
6.10 Bình định mức, dung tích 100 mL, 1000 mL.
6.11 Ống phancon, có nắp, dung tích 25 mL hoặc 50 mL.
6.12 Bộ rây, với kích thước 50 μm, 100 μm, 250 μm, 500 μm, 750 μm, 1 000 μm.
6.13 Pipet (Micropipet), dung tích 1 mL, 5 mL.
6.14 Bình tia, dung tích 500 mL.
6.15 Bộ lọc hút chân không, gồm có phễu và bình hút chân không
6.16 Giấy lọc Whatman số 2, hoặc màng lọc Cellulose nitrat có chia ô với đường kính lỗ 0,45 μm
6.17 Ống eppendorf, bằng nhựa, có nắp, thể tích 2 mL
7.1 Chuẩn bị dụng cụ
Các dụng cụ sử dụng trong đếm số lượng bào tử nấm nội cộng sinh Mycorrhiza phải được khử trùng bằng 1 trong 2 cách sau:
- giữở nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.6) sau đó sấy khô trong tủ sấy (6.7) hoặc;
- giữ ở nhiệt độ 180 °C không ít hơn 2 h trong tủ sấy (6.7).
7.2 Chuẩn bị mẫu
Cân 10 g mẫu trên cân phân tích (6.2), chính xác đến 0,001 g, cho vào bình tam giác dung tích 500 mL (6.8). Bổ sung 250 mL nước (5.1); Để yên trong 15 min; Lắc trên máy lắc ổn nhiệt (6.1) trong 15 min, tốc độ 150 r/min;
Để lắng trong 5 min, gạn dịch trong lần lượt qua các rây cổ kích thước 1 000 μm, 750 μm (6.12). Các bào tử nấm rễ được qua rây (trên mặt rây còn lại là các mảnh vụn hữu cơ có kích thước lớn);
Cho tiếp dịch trong qua rây có kích thước 500 μm, 250 μm, 100 μm, 50 μm(6.12). Các bào tử nấm rễ nội cộng sinh tùy kích cỡ khác nhau được giữ lại trên mặt rây cùng với những mảnh vụn hữu cơ;
Dùng bình tia (6.14) chứa nước (5.1), tia nhẹ từ 3 đến 5 lần lên bề mặt rây nhằm loại bỏ những mảnh vụn hữu cơ nhỏ bám vào bào tử nấm rễ nội cộng sinh;
Lật ngược từng rây, sử dụng bình tia (6.14) chứa nước (5.1) tia nhẹ để tách bào tử nấm rễ nội cộng sinh ra khỏi mặt rây;
CHÚ THÍCH 2: Mỗi cỡ rây nên sử dụng một cốc (6.9) để đựng dịch bào tử nấm rễ nội cộng sinh sau khi tiến hành tia ngược các rây.
Lấy pipet (6.13) hút toàn bộ hỗn hợp dịch chứa bào tử nấm rễ nội cộng sinh và các mảnh vụn hữu cơ nhỏ vào các ống phancon (6.11);
Ly tâm dịch trong bằng máy ly tâm (6.3) ở tốc độ 2 000 r/min trong 5 min;
Loại bỏ các mảnh vụn hữu cơ nhỏ nổi trên bề mặt ống phancon bằng cách sử dụng pipet hút bỏ1/2 dịch phía trên, phần dịch còn lại phía dưới của ống phancon chứa bào tử gọi là dịch bào tử nấm rễ nội cộng sinh.
Chuyển toàn bộ dịch bào tử nấm rễ nội cộng sinh (7.2) vào các ống phancon (6.11); Bổ sung dung dịch sucroza 50 % (5.2) theo tỷ lệ dung dịch sucroza 50 % : dịch chứa bào tử (7.2) là 1:1 (v/v). Lắc nhẹ bằng tay để dung dịch sucroza 50 % trộn đều với dịch bào tử nấm rễ nội cộng sinh. Ly tâm với tốc độ 2 000 r/min trong 10 min, các bào tử nấm rễ nội cộng sinh sẽ nổi lên trên bề mặt ống phancon;
CHÚ THÍCH 3: Có thể dùng nhiều ống phancon để chứa hết lượng dịch bào tử nấm rễ nội cộng sinh của một cỡ rây.
Sử dụng pipet (6.13) hút toàn bộ dịch nổi trên bề mặt ống phancon cho vào phễu lọc hút chân không (6.15) có đặt giấy lọc hoặc màng lọc chia ô (6.16); Dùng bơm hút chân không (6.4) hút chân không cho đến hết dịch trên phễu lọc hút chân không;
Quan sát các màng lọc dưới kính hiển vi nổi hoặc hiển vi thường (6.5) ở độ phóng đại phù hợp;
Đếm số bào tử trong 5 ô ngẫu nhiên để xác định số lượng bào tử nấm rễ nội cộng sinh có trong từng cỡ rây;
CHÚ THÍCH 4: Mỗi cỡ sàng sử dụng một màng lọc.
Lấy ngẫu nhiên một lượng bào tử nấm rễ nội cộng sinh nhất định (khoảng 100 bào tử) trong mỗi cỡ rây cho vào ống eppendorf vô trùng (6.17);
Bổ sung 1,5 mL dung dịch MTT 0,25 % (5.3) và ủ ở 27 °C, giữ trong tối;
Sau 72 h, quan sát bào tử nấm rễ nội cộng sinh dưới kính hiển vi soi nổi hoặc kính hiển vi thường(6.5). Những bào tử bắt màu đỏ hoặc hồng là những bào tử nấm rễ nội cộng sinh có hoạt tính (IP).
Số lượng bào tử nấm rễ nội cộng sinh có hoạt tính (A) trong 1 gram mẫu thử nghiệm được tính theo công thức sau:
(9.1) |
Trong đó:
Bi là số bào tử nấm rễ nội cộng sinh trong 5 ô ngẫu nhiên ở mỗi cỡ rây (50 μm, 100 μm, 250 μm, 500 μm), tính bằng bào tử (bt);
n là tổng số ô trong 1 tờ giấy lọc hoặc màng lọc, tính bằng ô;
U là số bào tử nấm rễ nội cộng sinh bắt màu hồng hoặc đỏ khi nhuộm, tính bằng bào tử (bt);
V là số bào tử nấm rễ nội cộng sinh khi nhuộm, tính bằng bào tử (bt);
2 là hệ số (bằng 100 bào tử lấy ngẫu nhiên trong mỗi cỡ rây : (5 ô ngẫu nhiên ở mỗi cỡ rây x 10 g mẫu thử)).
Nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:
- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- Phương pháp thử đã sử dụng: viện dẫn tiêu chuẩn nảy;
- Tất cả các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thểảnh hưởng đến kết quả;
- Các kết quả thử nghiệm thu được.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] National Centre of Organic Farming Department of Agriculture and Cooperation, Ministry of Agriculture, Govt of India, CGO-II, Kamla Nehru Nagar Ghaziabad, 201 001, Uttar Pradesh. 1985. Biofertilizers and Organic Fertilizers in Fertilizer (Control) Order, pp. 34 - 38.
[2] Brundrett. Mark et. Al. 1996. Working with Mycorrhiza in Forestry and Agriculture. Canberra, Australia, pp. 141 - 252.
[3] Carter M. R. 1993. Soil sampling and methds of analysis. Canadian society of soil scien. Lewis publishers.
[4] Trần Văn Mão, 2002. Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập 2: Sử dụng vi sinh vật có ích. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 247 - 276.