QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-8: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM PHOMA TRACHEIPHILA (PERTRI) KANTACHVELI & GIKACHVILI
Procedure for identification of plant disease caused by fungi
Part 2-8: Particular requirements for Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili
Lời nói đầu
TCVN 12195-2-8: 2019 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ TCVN 12195 Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật gồm các phần sau:
- Phần 1: Yêu cầu chung
- Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz
- Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr
- Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano
- Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Ciborinia camelliae Kohn
- Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với Boeremia foveata (Foister) Aveskamp, Gruyter & Verkley
- Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada
- Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Tilletia indica Mitra
- Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili
QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-8: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI NẤM PHOMA TRACHEIPHILA (PERTRI) KANTACHVELI & GIKACHVILI
Procedure for identification of plant disease caused by fungi
Part 2-8: Particular requirements for Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili
Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu về quy trình giám định nấm Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili gây bệnh thực vật.
Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 12195-1:2019, Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 1: Quy định chung.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:
3.1 Kính hiển vi: độ phóng đại từ 40 lần đến 1 000 lần
Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.
4.1 Agarose
4.2 Agar
4.3 Nước cất
5.1 Lấy mẫu
Lấy mẫu theo TCVN 12195-1:2019 (điều 5.1).
5.2 Bảo quản mẫu giám định
Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau khi giám định như sau:
+ Thân, cành, lá, quả, rễ bảo quản tươi, ép khô hoặc ngâm mẫu theo TCVN 12195-1: 2019 (điều 5.2.1)
+ Tiêu bản lam giám định theo TCVN 12195-1: 2019 (điều 5.2.4)
Cây khi bị nhiễm bệnh có thể dẫn tới hiện tượng chết ngọn, lá rụng, các cành và thân bị hóa khô.
Cành của cây nhiễm bệnh thường bị héo và nứt. Vỏ của các cành này thường biến màu thành nâu hoặc nâu nhạt. Trên cành có thể xuất hiện các vết nứt. Khi bệnh hại nặng các đoạn thân, cành bị khô đi vỏ ngoài biến màu xám tro. Trên bề mặt vết bệnh có thể quan sát thấy các hạt nhỏ màu đen.
Lá của cây nhiễm bệnh biến nâu hoặc nâu nhạt. Gân chính hoặc phụ của lá hóa trong. Lá rụng còn lại cuống lá. Đôi khi trên các lá rụng có hiện tượng gây biến thành màu đỏ.
Các mô gỗ già trên phần thân hóa hồng hoặc nâu.
Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các nước mà nấm có phân bố (xem phụ lục A) và các loài cây mà nấm gây hại (xem phụ lục A).
7.1 Giám định bằng đặc điểm hình thái
7.1.1 Kiểm tra trực tiếp
7.1.1.1 Kiểm tra mẫu tươi
- Quan sát hình thái của nấm thu được bằng một trong hai cách:
+ Kiểm tra mẫu tươi theo điều 7.1.1.1.1 của TCVN 12195-1:2019
+ Kiểm tra hình thái cấu trúc quả cành của nấm theo điều 7.1.1.1.2 của TCVN 12195-1:2019
+ Kiểm tra tiêu bản lam: Làm tiêu bản lam như điều 7.1.1.2 của TCVN 12195-1:2019
- Quan sát dưới kính hiển vi (3.1) đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm Phoma tracheiphila (xem 7.1.4).
7.1.2 Kiểm tra mẫu để ẩm
- Kiểm tra mẫu để ẩm theo điều 7.1.2 của TCVN 12195-1:2019.
- Quan sát dưới kính hiển vi (3.1) đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm Phoma tracheiphila (xem 7.1.4).
7.1.3 Phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhân tạo
- Phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trường nhân tạo theo điều 7.1.3 của TCVN 12195-1:2019.
- Sử dụng môi trường PDA (phụ lục B của TCVN 12195-1:2019) hoặc PCA (phụ lục B)
- Quan sát dưới kính hiển vi (3.1) đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm Phoma tracheiphila (xem 7.1.4).
7.1.4 Đặc điểm hình thái định loại của nấm Phoma tracheiphila
Quả cành hình cầu, hơi kéo dài thành một cổ ngắn có miệng nhỏ, màu đen đường kính (60 đến 165) µm x (45 đến 150) µm.
Các bào tử phân sinh nằm trong quả cành dạng đơn bào, kích thước (0,5 đến 1,5) µm x (2 đến 4) µm. Bào tử phân sinh được sinh ra từ các tế bào sinh bào tử. Bào tử phân sinh (phialoconidia) đơn bào thường có 1 đến 3 giọt dầu màu trong suốt, dạng thẳng hoặc cong, đầu bào tử tròn kích thước (1,5 đến 3) µm x (3 đến 8) µm thường được sản sinh bởi các tế bào sinh bào tử ở trên các sợi nấm tự do phát triển ở vùng gỗ trên thân lộ ra ngoài, phần mô bị thương hoặc trong mạch dẫn.
Bào tử chồi (blastoconidia) có dạng trứng hoặc dạng quả lê được sinh ra từ mạch dẫn cây kí chủ.
Hình 1: Quả cành của nấm Phoma tracheiphila
(NGUỒN: EPPO)
7.2 Giám định bệnh bằng phương pháp PCR
7.2.1 Tách chiết DNA
- DNA tổng số từ mô thân, lá, cành được tách chiết theo phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mô cây điều 7.2.1 của TCVN 12195-1:2019
- DNA tổng số từ sợi nấm nuôi cấy trên môi trường nhân tạo được tách chiết theo phương pháp tách chiết DNA tổng số từ sợi nấm trên môi trường điều 7.2.1 của TCVN 12195-1:2019
7.2.2 Nhân gen
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu:
Pt-FOR2 (5’-GGATGGGCGCCAGCCTTC-3')
Pt-REV2 (5’-GCACAAGGGCAGTGGACAAA-3')
Chu trình nhiệt:
| 94 °C trong 5 phút 94 °C trong 30 giây 65 °C trong 60 giây 72 °C trong 90 giây 72 °C trong 5 phút | Lặp lại 30 chu kì |
7.2.3 Đọc kết quả
Sản phẩm nhân gen được điện di trong gel agarose 1,5 % (4.1).
Mẫu dương tính cho ra đoạn gen kích thước 378 bp;
7.3 Kết luận
Mẫu giám định được kết luận là loài Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili khi
- Nấm có đặc điểm hình thái phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở điều 7.1.4.
hoặc
- Phương pháp PCR cho kết quả là dương tính.
Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:
- Thông tin về mẫu giám định.
- Tên loài
- Phương pháp giám định
- Người giám định/cơ quan giám định
Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục C.
A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
Tên tiếng Việt: Bệnh khô cành cam quýt
Tên khoa học: Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili
Tên khác: Bakerophoma tracheiphila (Petri) Cif.
Deuterophoma tracheiphila Petri
Vị trí phân loại:
Lớp: Dothideomycetes
Bộ: Pleosporales
Họ: Pleosporaceae
A.2 Phân bố
Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam
Châu Á: Armenia, Georgia, Iraq, Lebanon, Syria, Israel, Turkey, Yemen; Châu Phi: Tunisia, Egypt, Libya, Algeria; Châu Âu: Greece, Albania, Italy, Russian Federation, Cyprus, France, Belgum, Netherlands
A.3 Ký chủ
Citrus bergamia, Citrus limon, Citrus medica (phật thủ), Citrus reticulata (quýt), Citrus aurantium (Cam chua), Citrofortunella microcarpa, Citrus aurantiifolia, Citrus jambhiri, Citrus latifolia, Citrus limonia, Citrus macrophylla, Citrus sinensis, Citrus unshiu, Citrus x paradisi, Fortunella (quất), Poncirus trifoliata
A.4 Đặc điểm sinh học
Nấm xâm nhiễm thông qua vết thương trên lá, cành và rễ cây; có thể qua lỗ khí khổng. Các hoạt động canh tác cũng như gió, băng giá và mưa đá là các tác nhân gây sát thương các bộ phận của cây, tạo điều kiện thuận lợi cho xâm nhiễm. Lây nhiễm có thể bằng bào tử sinh tra từ quả cành bào tử trên các cành héo hoặc bào tử sinh ra từ các tế bào sinh bào tử trên các sợi nấm trên phần vỏ gỗ của cây hoặc tàn dư trên mặt đất. Bào tử phân sinh lan truyền bằng nước trên các bộ phận của cây. Điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là từ 14 °C đến 28 °C. Thời kì xâm nhiễm phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ của các khu vực và điều kiện mùa; ở Sicily, sự xâm nhiễm thường xảy ra vào thời điểm giữa tháng 9 và tháng 4. Điều kiện thích hợp nhất để tác nhân gây bệnh phát triển và biểu hiện triệu chứng là từ 20 °C đến 25 °C, trong khi đó điều kiện nhiệt độ cao nhất để cho nấm phát triển trong môi trường là 30 °C. Các cành đốn tỉa bị bệnh có thể là nguồn lây lan bệnh trong vài tuần. Khi nhiệt độ vào khoảng từ 20 °C đến 25 °C và độ ẩm gần bão hòa là điều kiện thích hợp nhất cho tế bào sinh bào tử phát triển ở vết thương cũng như các vết sẹo lá tự nhiên. Nấm có thể tồn tại trên cành nhiễm bệnh trên mặt đất hơn 4 tháng.
Môi trường PCA
Thành phần:
| Nước chiết khoai tây | 200 ml |
| Nước chiết cà rốt | 250 ml |
| Agar (4.2) | 15 g |
| Nước cất (4.3) | 1 000 ml |
Hòa tan hoàn toàn các thành phần vào nước cất, hấp khử trùng (xem Phụ lục B của TCVN 12195-1:2019)
| Cơ quan giám định | CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM |
…………. ngày ... tháng ... năm 20…
PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH
1. Tên hàng hóa:
2. Nước xuất khẩu:
3. Xuất xứ:
| 4. Phương tiện vận chuyển: | Khối lượng: |
5. Địa điểm lấy mẫu:
6. Ngày lấy mẫu:
7. Người lấy mẫu:
8. Tình trạng mẫu:
9. Ký hiệu mẫu:
10. Số mẫu lưu:
11. Người giám định:
12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12195-2-8:2019. Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili.
13. Kết quả giám định:
Tên tiếng Việt: Bệnh khô cành cam quýt
Tên khoa học: Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili
Vị trí phân loại:
Lớp: Dothideomycetes
Bộ: Pleosporales
Họ: Pleosporaceae
| TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT | THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ |
[1] CABI, (2018), Crop Protection Compedium.
[2] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.
[3] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.
[4] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.
[5] Viện Nấm học quốc tế IMI, (1994), Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng, Lớp tập huấn 08-15/12/1994, tại Viện Bảo vệ thực vật, Hà Nội.
[6] https://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/factsheets/index.cfm?thisapp=Phomatracheiphila