TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 11289:2016
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DIMETRIDAZOLE - PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ
Animal feeding stuffs - Determination of dimetridazole content- Spectrophotometric method
Lời nói đầu
TCVN 11289:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 970.85 Dimetridazole in Feeds. Spectrophotometric Method;
TCVN 11289:2016 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DIMETRIDAZOLE - PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ
Animal feeding stuffs - Determination of dimetridazole content- Spectrophotometric method
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đo quang phổ để xác định hàm lượng dimetridazole trong thức ăn chăn nuôi.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6952 (ISO 9498), Thức ăn chăn nuôi- Chuẩn bị mẫu thử.
3 Nguyên tắc
Dimetridazole được chiết ra khỏi phần mẫu thử bằng metanol, sau đó tách các chất gây nhiễu bằng hai bước sắc ký nhôm oxit và xác định bằng đo quang phổ ở bước sóng UV có độ hấp thụ cực đại đối với dimetridazole.
CHÚ THÍCH: Các chất gây nhiễu gồm nihydrazone, furazolidone, zoalene, 2-chloro-4-nitrobenzamide, tylosin và procaine (một lượng lớn từ penicillin procain).
4 Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại ion, trừ khi có quy định khác.
4.1 Nhôm oxit(Al2O3), thích hợp dùng cho sắc ký
Nhôm oxit thích hợp dùng cho sắc ký khi đạt yêu cầu của phép thử sau đây: Lắc mạnh 10 g nhôm oxit (alumina) với 100 ml nước đựng trong bình cầu 250 ml có nút đậy thủy tinh trên 2 min. Để lắng, gạn và xác định pH bằng đo điện thế. Trị số pH phải trong khoảng từ 9,5đến 10,5. Hiệu quả chiết dimetridazole có thểthay đổi tùy thuộc vào các loại nhôm oxit khác nhau. Kiểm tra hiệu quả chiết của cột bằng cách thực hiện phép xác định trên mẫu thử không chứa dimetridazole hoặc các imidazole khác. Nếu mẫu có chứa lớn hơn 0,004 % imetridazole thì sử dụng loại nhôm oxit khác.
4.2 Dung dịch chuẩn 1,2-dimethyl-5-nitroimidazole (dimetridazole, C5H7N3O2)
4.2.1 Dung dịch chuẩn gốc, 0,1 mg/ml
Cân 100 mg chất chuẩn dimetridazole, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 100 ml. Hòa tan trong nước bằng cách lắc trong khoảng 20 min. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. Dùng pipet lấy 20 ml cho vào bình định mức 200 ml, thêm nước đến vạch và trộn.
4.2.2 Dung dịch chuẩn làm việc, nồng độ tương ứng 2,5; 5; 10; 15 và 20 µg/ml
Dùng pipet lấy 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml và 40 ml dung dịch chuẩn gốc (4.2.1) cho vào các bình định mức 100 ml riêng rẽ. Thêm 5,0 ml dung dịch axit clohydric 3 M (4.3) vào mỗi bình, thêm nước ngay đến vạch và trộn. Dùng pipet lấy mỗi dung dịch 5 ml và 5 ml dung dịch natri hydroxit 0,10 M (4.5) cho vào các bình nón 50 ml riêng rẽ. Đậy nút bình nón và trộn.
4.3 Dung dịch axit clohydric (HCI), 3 M.
4.4 Dung dịch axit clohydric, 0,15 M.
4.5 Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 0,10 M.
4.6 Metanol (CH3OH).
5 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:
5.1 Máy đo quang phổ, đo được ở bước sóng UV có độ hấp thụ cực đại với dimetridazole.
5.2 Ống sắc ký, kích thước 13 mm x 150 mm và 15 mm x 250 mm, phần đáy được thu hẹp để giữ nút bông thủy tinh và giữ ống thoát có đường kính ngoài 6 mm.
5.3 Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml và 200 ml.
5.4 Bình nón, dung tích 50 ml.
5.5 Bình cầu đáy tròn, dung tích 125 ml.
5.6 Pipet
5.7 Nồi cách thủy, có thể duy trìở nhiệt độ 60 °C.
5.8 Bếp điện.
5.9 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
6 Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi- Lấy mẫu.
7 Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498).
8 Cách tiến hành
8.1 Dựng đường chuẩn
Tiến hành theo 8.4, sử dụng các dung dịch chuẩn làm việc (4.2.2) và mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách trộn 5 ml dung dịch axit clohydric 0,15 M (4.4) với 5 ml dung dịch natri hydroxit 0,10 M (4.5).
Xác định độ hấp thụ so với mẫu trắng. Dựng đường chuẩn của độ hấp thụ theo nồng độ dimetridazole, tính bằng microgam trên mililit.
8.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
Cân phần mẫu thử có chứa từ 0,5 mg đến 2,0 mg dimetridazole (thường là 5 g phần mẫu thử), chính xác đến 1 mg, cho vào bình định mức 100 ml (5.3). Thêm từ 70 ml đến 75 ml metanol (4.6) và đặt vào nồi cách thủy ở 60 °C (5.7) trong 30 min. Đảm bảo mức nước ngập bình cầu đến khoảng 3 mm dưới mức metanol. Xoay bình hai hoặc ba lần trong 5 min đầu tiên để làm nóng đồng đều. Làm nguội đến nhiệt độ phòng, pha loãng tới vạch bằng metanol và trộn đều. Để yên từ 5 min đến 10 min để cho các hạt thô của mẫu lắng xuống.
8.3 Chuẩn bị cho sắc ký
Chèn nút bông thủy tinh nhỏ vào đáy cột sắc ký 15 mm x 250 mm (5.2) và phủ một lớp nhôm oxit dày 8 cm, nhồi chặt cột. Gạn lớp dịch chiết trong metanol sang cột sao cho các hạt lắng của mẫu không đi vào cột. Thu lấy khoảng 30 ml dịch chiết cho vào bình định mức 50 ml (5.3). Đậy nút bình cho đến khi sử dụng.
LƯU Ý: Dimetridazole thăng hoa ở nhiệt độ trên 70 °C, do đó cách loại bỏ dung môi là rất quan trọng.
Đối với mẫu thử có chứa hàm lượng dimetridazole 150 mg/kg, dùng pipel lấy 15 ml dịch rửa giải (lấy4 ml nếu mẫu chứa 600 mg/kg, 3 ml nếu mẫu chứa 1000 mg/kg) vào bình hút 125 ml hoặc bình cầu đáy tròn 125 ml (5.5) và cho bay hơi dưới áp suất thấp. Nếu lấy 15 ml thì sử dụng bếp điện (5.8) (có nhiệt độ thấp) hoặc nồi cách thủy (5.7) để giảm thể tích còn khoảng từ 3 mlđến 4 ml. Lắc để tránh sôi mạnh. Khi đạt đến khoảng từ 3 ml đến 4 ml, lấy bình ra khỏi nguồn nhiệt và sử dụng nhiệt từ lòng bàn tay để đuổi 3 ml đến 4 ml cuối cùng này. Tiếp tục lắc để tránh sôi mạnh. Không cố gắng để làm khô hoàn toàn, vì khoảng 2 đến 3 giọt còn lại chính là dimetridazole.
Rửa thành bình, bắt đầu từ cổ bình, dùng 5,0 ml dung dịch natri hydroxit 0,10 M (4.5). Xoay để rửa thành bình. Để yên 5 min và thêm 5,0 ml dung dịch axit dohydric 0,15 M (4.4). Xoay bình để trộn và rửa thành bình. Đậy nút cho đến khi chạy sắc ký.
8.4 Phép xác định
Chuẩn bị cột nhóm oxit thứ hai bằng cách chèn bông thủy tinh nhỏ vào đáy cột sắc ký 13 mm x 150 mm (5.2), phủ lớp nhôm oxit 4 cm và gõ nhẹ để nhồi cột. Rót toàn bộ 10 ml dung dịch vào cột và để cho dung dịch đi qua cột. Thu lấy dịch rửa giải vào bình nón 50 ml (5.4). Đẩy phần chất lỏng bám vào cột bằng cách dùng áp lực không khí từ bóng cao su. Xoay bình để trộn. Đậy nút bình cho đến khi sẵn sàng đo quang.
Thực hiện với mẫu trắng, dùng 5 ml dung dịch axit clohydric 0,15 M (4.4) và 5 ml dung dịch natri hydroxit 0,10 M (4.5) qua cột riêng biệt có lớp nhôm oxit cao 4 cm nói trên.
a) Sử dụng máy quang phổ tự ghi
Cho thuốc thử trắng và dung dịch mẫu thử (luôn luôn sử dụng cùng một cuvet cho mẫu trắng) vào đầy hai cuvet silic dioxit (silica) đã đánh dấu và quét từ 310 nm đến 330 nm. Đọc độ hấp thụở pic và xác định nồng độ của dung dịch (microgam trên mililit) từ đường chuẩn.
b) Sử dụng máy đo quang phổ thủ công
Xác định vị trí pic hấp thụ cực đại của dung dịch mẫu (khoảng 318 nm), sử dụng cặp cuvet silica đã đánh dấu và cài đặt bước sóng theo pic. Đọc độ hấp thụ của dung dịch phần mẫu thử và của dung dịch mẫu trắng, rồi hiệu chỉnh theo độ hấp thụ của mẫu trắng. Đọc độ hấp thụ ở pic và xác định nồng độ của dung dịch (tính bằng microgam trên mililit) từ đường chuẩn.
9 Tính kết quả
Hàm lượng dimetridazole của phần mẫu thử, X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), theo công thức sau:
Trong đó:
C là nồng độ dimetridazole của dung dịch, xác định từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);
D là hệ số pha loãng :
D = 66,67 nếu mẫu thử chứa hàm lượng dimetridazole 150 mg/kg;
D = 250,0 nếu mẫu thử chứa hàm lượng dimetridazole 600 mg/kg;
D= 333,3 nếu mẫu thử chứa hàm lượng dimetridazole 1000 mg/kg;
w là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam.
10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thểảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.