TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 11286:2016
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BUQUINOLATE - PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG
Animalfeeding stuffs - Determination of buquinolate content - Flurometric method
Lời nói đầu
TCVN 11286:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 967.34 Buquinolate in feeds. Flurometric method;
TCVN 11286:2016 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BUQUINOLATE - PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG
Animalfeeding stuffs - Determination of buquinolate content - Flurometric method
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đo huỳnh quang để xác định hàm lượng buquinolate trong thức ăn chăn nuôi.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6952 (ISO 9498), Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.
3 Nguyên tắc
Buquinolate được chiết ra khỏi phần mẫu thử bằng cloroform, dịch chiết được cô đặc và tách ra khỏi các chất gây nhiễu bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng hai hệ dung môi. Buquinolate được rửa giải ra khỏi cơ chất và được xác định bằng phép đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 265 nm và bước sóng phát xạ 375 nm.
4 Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại ion, trừ khi có quy định khác.
4.1 Etanol (C2H5OH), dung dịch 80 % (thể tích)
Pha loãng 84,3 ml etanol 95 % (thể tích) đến 100 ml bằng nước.
4.2 Cloroform (CHCl3).
4.3 Dung môi khai triển
Trộn cloroform và etanol theo tỷ lệ 10 : 1 (phần thể tích). Chuẩn bị dung môi này trong ngày sử dụng.
4.4 Dung dịch chuẩn buquinolate (C20H27NO5)
4.4.1 Dung dịch chuẩn gốc buquinolate, 0,5 mg/ml
Cân 50,0 mg chất chuẩn buquinolate, chính xác đến 0,1 mg, hòa tan bằng cloroform (4.2) trong bình định mức 100 ml, thêm cloroform đến vạch. Làm ấm hỗn hợp trên nồi cách thủy nếu cần.
Dung dịch này khi được bảo quản trong lọ kín, tránh bay hơi có thể bền được 1 tháng.
4.4.2 Dung dịch chuẩn làm việc buquinolate, 100 µg/ml
Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch chuẩn gốc (4.4.1) cho vào bình định mức 25 ml, thêm cloroform đến vạch và trộn đều.
Chuẩn bị dung dịch này trong ngày sử dụng.
4.5 Axeton (C3H6O).
5 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:
5.1 Máy đo huỳnh quang, có thể sử dụng máy đo phổ huỳnh quang hoặc máy đo huỳnh quang có bộ lọc thích hợp, hoạt động ở bước sóng kích thích 265 nm và bước sóng phát xạ 375 nm.
5.2 Bể khai triển, có lót bằng giấy sắc ký Whatman 3 MM (đối với các tấm kích thước nhỏ hơn 20 cm x 20 cm). Cho 100 ml cloroform vào một bể và cho 100 ml dung môi khai triển (4.3) vào một bể khác. Chuẩn bị bể ngay trong ngáy sử dụng.
5.3 Tấm sắc ký lớp mỏng (TLC), làm sạch kỹ các tấm bằng chất tẩy rửa alkyl benzen sulfonat và bàn chải. Tráng các tấm này bằng nước, sau đó bằng axeton (4.5). Để các tấm này khô trong không khí. Tạo hồ nhão từ 60 g silica gel G bằng 120 ml nước. Rót hồ nhão này sang dụng cụ tráng thích hợp và dàn thành lớp dày 0,5 mm lên các tấm sắc ký kích thước 20 cm x 20 cm. Làm khô trong không khí từ 15 min đến 30 min, sau đó sấy khô ở 110 °C trong 2 h. Làm nguội và bảo quản các tấm đã chuẩn bị trong bình hút ẩm cho đến khi sử dụng.
5.4 Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 100 ml.
5.5 Bình nón, dung tích 25 ml và 250 ml, có nút thủy tinh đậy kín.
5.6 Cốc có mỏ, dung tích 150 ml.
5.7 Pipet
5.8 Nồi cách thủy.
5.9 Máy lắc cơ học.
5.10 Máy ly tâm.
5.11 Cuvet thạch anh (10 mm x 10 mm).
5.12 Phễu Buchner.
5.13 Giấy lọc Whatman số 54.
5.14 Rây số 30.
5.15 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
6 Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.
7 Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498), nghiền khoảng 100 g mẫu thử đến khi phần mẫu thử lọt hết qua rây số 30 (5.14).
8 Cách tiến hành
Cân phần mẫu thử chứa khoảng 1,25 mg buquinolate, chính xác đến 1 mg, cho vào bình nón 250 ml có nút đậy kín (5.5). Dùng pipet lấy 100 ml cloroform (4.2) cho vào phần mẫu thử trong bình. Lắc 1 h trên máy lắc cơ học (5.9), lọc dịch chiết qua giấy lọc Whatman số 54 (5.13) để trên phễu Buchner (5.12) có hút chân không nhẹ. Chú ý không để thất thoát dung môi do bay hơi. Chuyển chính xác 80 ml dịch chiết sang cốc có mỏ 150 ml (5.6) và cho bay hơi đến khô trên nồi cách thủy (5.8). Lấy phần cặn ra bằng các lượng nhỏ cloroform và dùng các lượng nhỏ cloroform để chuyển sang bình định mức dung tích 10 ml (5.4). Thêm cloroform đến vạch và trộn kỹ.
Đưa 250 µl dịch chiết (dịch pha loãng cuối cùng trong bình định mức dung tích 10 ml) và 250 µl dung dịch chuẩn làm việc (4.4.2) lên tấm sắc ký lớp mỏng (5.3). Tạo các chấm cách đáy tấm sắc ký khoảng 25 mm và cách nhau 40 mm. Không để pipet chạm vào tấm sắc ký. Đặt tấm sắc ký vào bể khai triển chứa cloroform (5.2) cho đến khi dung môi gần chạm vào đỉnh của tấm sắc ký (mất khoảng 1 h). Lấy ra, để khô tấm sắc ký trong không khí từ 5 min đến 10 min. Quan sát tấm sắc ký dưới ánh sáng UV bước sóng ngắn, buquinolate giữ nguyên điểm ban đầu và nền mẫu dịch chuyển.
Chuyển tấm sắc ký (đã làm khô trong không khí từ 5 min đến 10 min) vào bể chứa dung môi khai triển (4.3). Đặt tấm sắc ký trong bể cho đến khi dung môi cách đỉnh tấm 12 cm. Lấy ra, để khô tấm sắc ký trong không khí từ 5 min đến 10 min. Quan sát tấm sắc ký dưới ánh sáng UV bước sóng ngắn. Buquinolate dịch chuyển ra khỏi điểm ban đầu (Rf từ 0,4 đến 0,6). Dùng dao khoanh từng chấm buquinolate cùng với chấm trắng có Rf và diện tích tương đương. Loại bỏ chất hấp phụ xung quanh các chấm buquinolate. Chuyển định lượng từng chấm vào từng bình nón 25 ml có nút thủy tinh (5.5). Dùng pipet lấy 10 ml etanol 80 % thể tích (4.1) cho vào mỗi bình và lắc trên máy lắc cơ học 20 min rồi ly tâm.
Xác định cường độ bức xạ huỳnh quang (l) của phần mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng trong các cuvet thạch anh (5.11) trong máy đo huỳnh quang (5.1) ở bước sóng kích thích 265 nm và bước sóng phát xạ 375 nm.
9 Tính kết quả
Hàm lượng buquinolate có trong phần mẫu thử, X, tính bằng phần trăm khối lượng, được tính bằng công thức sau:
Trong đó:
ITlà cường độ phát xạ huỳnh quang của phần mẫu thử;
IBlà Cường độ phát xạ huỳnh quang của mẫu trắng;
lSlà cường độ phát xạ huỳnh quang của mẫu chuẩn;
0,250 là thể tích dung dịch chuẩn làm việc được chuyển lên tấm sắc ký lớp mỏng, tính bằng mililit (tương đương 250 µl);
100 là nồng độ dung dịch chuẩn làm việc buquinolate, tính bằng microgam trên mililit;
10-6là hệ số chuyển đổi từ microgam sang gam;
V1là thể tích cloroform cho vào phần mẫu thử, tính bằng mililit (V1 = 100 ml);
V2là thể tích dịch chiết được chuyển sang cốc có mỏ, tính bằng mililit (V2 = 80 ml);
V3là dung tích bình định mức chứa dịch pha loãng cuối cùng, tính bằng mililit (V3 = 10 ml);
V4là thể tích dịch pha loãng cuối cùng được chuyển lên tấm sắc ký lớp mỏng, tính bằng mililit (V4 = 0,250 ml);
w là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam.
10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thểảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.