TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 10786:2015
PHÂN BÓN VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA AZOTOBACTER - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG KHÍ ETYLEN
Microbial fertilizer - Determination ofnitrogen fixing activity of azotobacter - Method for quantitation of ethylene gas
Lời nói đầu
TCVN 10786:2015 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
PHÂN BÓN VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA AZOTOBACTER -PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG KHÍ ETYLEN
Microbial fertilizer - Determination ofnitrogen fixing activity of Azotobacter - Method for quantitation of ethylene gas
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng khí etylen để xác định khả năng cố định nitơ của phân vi sinh vật, phân hữu cơ vi sinh vật có chứa vi khuẩn Azotobacter.
2 Tài liệu viện dẫn
Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6166:2002, Phân bón vi sinh vật cố định nitơ.
3 Thuật ngữ, định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ, định nghĩa sau:
3.1
Hoạt tính cố định nitơ của Azotobacter(nitrogen fixing activity of Azotobacter)
Khả năng của Azotobacter tạo hợp chất chứa nitơ từ nitơ trong khí quyển dưới tác dụng của nitrogenaza.
4 Nguyên tắc
Hoạt tính cố định nitơ được xác định bằng cách đo lượng etylen tạo thành bằng phương pháp sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa qua quá trình khử axetylen thành etylen dưới sự xúc tác của nitrogenaza. Phản ứng khử axetylen thành etylen theo phương trình sau:
C2H2 + 2H + 2e → C2H4
5 Thuốc thử, dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy
Hoá chất sử dụng để pha các chất chuẩn đạt loại tinh khiết hoá học, hoá chất sử dụng đểphân tích đạt loại tinh khiết phân tích.
5.1 Khí etylen chuẩn, có độ tinh khiết 99,9 %.
5.2 Khí axetylen, có độ tinh khiết 99,9 %.
5.3 Dịch pha loãng
Dịch pha loãng là nước muối sinh lý (NaCI 0,85 %), vô trùng, pH = 7, không chứa các hợp chất nitơ;
Lấy 9 ml dịch pha loãng cho vào ống nghiệm (6.2.4)hoặc90mldịchpha loãng cho vào bình tamgiác (6.2.1), đậy nút bông và khử trùng ở 121 °C không íthơn20 mintrong nồi hấp áplực (6.1.2).
5.4 Môi trường nuôi cấy
5.4.1 Thành phần
Có thể sử dụng các môi trường có bán sẵn trên thị trường hoặc môi trường dưới đây:
5.4.1.1 Môi trường Ashby
Mannitol (C6H8(OH)6) | 20,0 g |
Dikali hydro phosphat (K2HPO4) | 0,2 g |
Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7 H2O) | 0,2 g |
Natri clorua (NaCI) | 0,2 g |
Kali sulphat (K2SO4) | 0,1 g |
Canxi cacbonat (CaCO3) | 5,0 g |
Thạch | 20,0 g |
Nước cất vừa đủ | 1000 ml |
pH: 7,0 đến 7.2 |
|
5.4.1.2 Môi trường Azotobacter chroococum
Glucoza (C6H12O6) | 20,0 g |
Canxi cacbonat (CaCO3) | 20,0 g |
Dikali hydro phosphat (K2HPO4) | 0,8 g |
Kali dihydro phosphat (KH2PO4) | 0,2 g |
Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4 .7 H2O) | 0,5 g |
Sắt (III) clorua ngậm sáu phân tử nước (FeCI3.6 H2O) | 0,1 g |
Natri molybdat ngậm hai phân tử nước (Na2MoO4.2 H2O) | 0,05 g |
Thạch | 20,0 g |
Nước cất vừa đủ | 1000 ml |
pH: 7,2 đến 7,4 |
|
5.4.2 Cách chuẩn bị
Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho (5.4.1).
Phân phối lượng từ 100 ml đến 150 ml môi trường vào bình tam giác dung tích 250 ml (6.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1.2), làmnguội đến 50 °C.
Phân phối lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào các đĩa Petri(6.2.3)đãđược chuẩn bị sẵn (theo6.3); Các thao tác tiến hành trong tủ cấy vô trùng (6.1.1).
6 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và cụ thể như sau:
6.1 Thiết bị
6.1.1 Tủ cấy vô trùng, vận tốc dòng khí trung bình 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m3/h, màng lọc ULPA với kích thước hạt từ 0,1 μm đến 0,3 μm.
6.1.2 Nồi hấp áp lực, áp suất tối thiểu 101,3 kPa, nhiệt độ 121 °C.
6.1.3 Tủ sấy, nhiệt độ từ 40 °C đến 260 °C.
6.1.4 Tủ ấm, nhiệt độ từ 20 °C đến 60 °C.
6.1.5 Máy sắc ký khí, detector ion hóa ngọn lửa (FID).
6.1.6 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,001 g.
6.1.7 Cân kỹ thuật,có độ chính xác đến 0,01 g.
6.1.8 Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ 150 r/min, nhiệt độ từ 20 °C đến 40 °C.
6.1.9 Máy trộn Vortex, tốc độ 1000 r/min.
6.1.10 Máy đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.
6.2 Dụng cụ
6.2.1 Bình tam giác, có dung tích 250 ml
6.2.2 Lọ/bình tam giác, có nút cao su, dung tích 100 ml.
6.2.3 Đĩa Petri, đường kính 90 mm.
6.2.4 Ống nghiệm, kích thước 18 mm x 180 mm.
6.2.5 Que gạt mẫu (que trang).
6.2.6 Pipet (Micropipet), có thể lấy cácthể tích0,1 ml,1ml, 10 ml.
6.2.7 Xylanh (bơm tiêm), có thể lấy các thểtích 0,1ml,9ml.
6.2.8 Cốc thủytinh, dung tích 1000 ml.
6.3 Chuẩn bị dụng cụ
Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được rửa sạch, tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây:
- Khử trùng khô: Giữ ở nhiệt độ 180 °C không ít hơn 1 h trong tủ sấy (6.1.3) hoặc;
-Khử trùng ướt: Giữ ở nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2).
7 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
7.1 Lấy mẫu
Lấy mẫu theo Điều 5 TCVN 6166:2002.
7.2 Chuẩn bị mẫu
Đối với mẫu dạng lỏng: Dùng pipet vô trùng lấy 10 ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 90 ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (5.3). Trộn bằng máy lắc (6.1.8), khoảng từ 5 min đến 10 min, sao cho vi sinh vật trong dung dịch phân bố đồng đều. Dung dịch tạo ra được gọi là dung dịch mẫu ban đầu;
Đối với mẫu dạng đặc: Cân 10 g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90 ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (5.3). Trộn bằng máy lắc (6.1.8), khoảng từ 5 min đến 10 min, sao cho vi sinh vật trong dung dịch phân bố đồng đều. Để cho các phần tử nặng lắng xuống trong thời gian không quá 15 min, gạn, được dung dịch mẫu ban đầu.
8 Xác định sự có mặt của Azotobacter trong phân bón
8.1 Cách tiến hành
Dùng một pipet vô trùng lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (5.3), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, trộn đều bằng máy trộn Vortex (6.1.9) để có dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10-2. Tiếp tục pha loãng để đạt được độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 đối với phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng và đạt được độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 đối với phân bón vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng;
Dùng pipet vô trùng khác lấy 0,1 ml dịch mẫu pha loãng cấy vào đĩa Petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (5.4). Mỗi nồng độ pha loãng được cấy lặp lại không ít hơn 2 đĩa Petri;
Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch mẫu thấm đều trên bề mặt thạch, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa Petri.
Nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C, trong thời gian từ 3 ngày đến 4 ngày.
Quan sát khuẩn lạc Azotobacter đặc trưng (Xem phụ lục A) trên các đĩa Petri.
8.2 Khẳng định
Trên đĩa Petri xuất hiện khuẩn lạc Azotobacter đặc trưng chứng tỏ phân bón có chứa Azotobacter.
9 Xác định khả năng cố định nitơ của phân bón vi sinh vật
9.1 Cách tiến hành
Cân chính xác 2 g phân bón cho vào lọ/bình tam giác dung tích 100 ml (6.2.2) đã chuẩn bị ở trên (6.3), bổ sung vào lọ/bình tam giác 1 g glucoza và 7 ml nước cất. Nút kín lọ/bình tam giác bằng nút cao su.
Dùng xi lanh thay thế 9 ml khí trong lọ/bình tam giác bằng 9 ml axetylen (5.2). Tiến hành ủ mẫu ở điều kiện nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C, trong thời gian 7 ngày.
Định lượng khí etylen được tiến hành trên máy sắc ký khí dựa trên việc so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thínghiệm với mẫu chuẩn.
Tùy theo cấu trúc và tính năng tác dụng của từng loại máy sắc ký khí mà chế độ đo của các máy khác nhau. Các điều kiện chạy máy cần tham khảo tài liệu hướng dẫn của máy như nhiệt độ đầu bơm mẫu, nhiệt độ lò, cột tách, tốc độ khí mang, nhiệt độ detector, tốc độ khí đốt cho phù hợp (Xem phụ lục B). Nguyên tắc chung có thể tiến hành như sau:
-Bật máy sắc ký khí cho máy đạt chế độ làm việc ổn định;
-Bơm 0,1 ml mẫu etylen chuẩn (5.1) vào máy sắc ký khí, xác định diện tích (hoặc chiều cao) pic;
-Bơm 0,1 ml mẫu thử vào máy sắc ký khí, xác định diện tích (hoặc chiều cao) pic.
CHÚ THÍCH: Khí etylen chuẩn nên pha loãng 100 lần.
9.2 Tính và biểu thị kết quả
Kết quả được tính dựa trên sự so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic etylen của mẫu thử và mẫu chuẩn. Lượng etylen tạo thành Mx, được tính theo công thức:
(nM)
trong đó
Mx là lượng etylen tạo thành, tính bằng nmol (nM);
Cs là nồng độ etylen trong mẫu chuẩn; tính bằng nmol (nM);
Ls là diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn, tính bằng xentimétvuông (cm2)hoặc xentimét (cm);
Lx là diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử, tính bằng xentimét vuông (cm2)hoặc xentimét (cm);
Vx là thể tích pha khí của lọ thửnghiệm, tính bằng mililit (ml);
22,4 x 10-6 hằng số Avogadro.
10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:
-Thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
-Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
-Tất cả các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
-Các kết quả thử nghiệm thu được;
-Nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
Phụ lục A
(Tham khảo)
Đặc điểm khuẩn lạc đặc trưng của một số loài thuộc Azotobacter thường sử dụng trong phân bón vi sinh vật
STT | Tên loài | Đặc điểm khuẩn lạc |
1 | Azotobacter chroococcum | Khuẩn lạc nhày, mép trơn, khá lồi, màu nâu sáng, về già chuyển nhăn nheo, màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường, kích thước 5-7 mm. |
2 | Azotobacter vinelandii | Khuẩn lạc nhày, mép trơn, khá lồi, màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường, kích thước 4-5 mm. |
3 | Azotobacter bejeinckii | Khuẩn lạc nhày, mép trơn, lồi, màu vàng hoặc không màu, sắc tố không khuếch tán vào môi trường, kích thước 4-5 mm. |
Phụ lục B
(Tham khảo)
Chế độ đo cho máy sắc ký khí
B.1 Nhiệt độ đầu bơm mẫu: 150 °C
B.2 Nhiệt độ lò: 250 °C
B.3 Cột tách: Cột nhồi, 2 m x 2 mm
B.4 Tốc độ khí mang (nitơ): 30 ml/min
B.5 Nhiệt độ detector: 140 °C
B.6 Tốc độ khí đốt:
B.6.1 Khí hydro: 35 ml/min
B.6.2 Không khí: 350 ml/min