VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÒA TAN KALI
Microorganisms - Determination of potassium solubilization capability
Lời nói đầu
TCVN 10785:2015 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÒA TAN KALI
Microorganisms - Determination of potassium solubilization capability
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính và định lượng khả năng hòa tan kali từ những hợp chất vô cơ chứa kali khó tan của vi sinh vật.
Các tài liệu viện dẫn sau đây là cần thiết để áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau:
3.1
Vi sinh vật hòa tan kali (potassium solubilizing microorganisms)
Các vi sinh vật có khả năng hòa tan, giải phóng kali từ những hợp chất vô cơ chứa kali khó tan.
4.1 Nguyên tắc định tính
Vi sinh vật dùng để xác định khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol axetic (IAA) là vi sinh vật thuần.
Tạo vòng trong bao quanh khuẩn lạc/ cụm khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường thạch.
4.2 Nguyên tắc định lượng
Sử dụng phương pháp quang kế ngọn lửa để xác định lượng ion K+ hòa tan được giải phóng ra trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
5 Thuốc thử, dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy
Hóa chất sử dụng để pha các chất chuẩn đạt loại tinh khiết hóa học, hóa chất sử dụng để phân tích đạt loại tinh khiết phân tích.
5.1 Nước cất, đáp ứng các yêu cầu nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).
5.2 Dung dịch axit clohydric (HCI) 0,1 N (pha từ dung dịch tiêu chuẩn HCI 1 N).
5.3 Dung dịch chuẩn
5.3.1 Dung dịch chuẩn gốc kali clorua 1000 mg K/l
Sử dụng dung dịch chuẩn gốc kali clorua 1000 mg K/l có sẵn trên thịtrường hoặc pha chế như sau:
Cần 1,9067g kali clorua (KCI) tinh khiết (99%) đã sấy khô ở 105 °C đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm cho vào cốc và thêm 100 ml dung dịch HCI 0,1 N, khuấy tan, chuyển vào bình định mức dung tích 1000 ml, thêm nước đến vạch định mức, trộn đều.
5.3.2 Dung dịch chuẩn làm việc kali clorua 100 mg K/l
Dùng pipet lấy 25,0 ml dung dịch chuẩn gốc kali clorua 1000 mg K/l (5.3.1) cho vào bình định mức dung tích 250 ml (6.2.3), thêm 2,5 ml dung dịch HCI 0,1 N. Thêm nước đến vạch định mức, trộn đều.
5.3.3 Thang chuẩn kali
Chuẩn bị7 bình định mức dung tích 100 ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 7. Dùng pipet lần lượt hút dung dịch chuẩn làm việc kali clorua 100 mg K/l (5.3.2) vào các bình định mức theo thể tích ghi trong bảng 1. Thêm dung dịch HCI 0,1 N đến vạch định mức, trộn đều.
Bảng 1 - Hướng dẫn pha thang chuẩn kali
STT | Nồng độ dung dịch kali clorua (mg K/l) | Thể tích dung dịch chuẩn làm việc kali clorua 100 mg K/l (ml) cho vào mỗi bình định mức dung tích 100 ml |
1 | 00,0 | 0,0 |
2 | 05,0 | 5,0 |
3 | 10,0 | 10,0 |
4 | 20,0 | 20,0 |
5 | 40,0 | 40,0 |
6 | 60,0 | 60,0 |
7 | 80,0 | 80,0 |
5.3.4 Đường chuẩn kali
Đo thang chuẩn kali trên máy quang kế ngọn lửa với kính lọc kali, hiệu chỉnh máy sao cho đường chuẩn có dạng y=ax + b (với R2 lớn hơn 0,95);
Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương trình tương đương) biểu diễn tương quan giữa số đo trên máy và nồng độ dung dịch chuẩn kali.
CHÚ THÍCH 1: Tùy theo hàm lượng kali hòa tan do vi sinh vật giải phóng ra trong dung dịch, có thể pha dung dịch chuẩn làm việc và thang chuẩn có nồng độ kali clorua thấp hơn hoặc cao hơn.
5.4 Dịch pha loãng
Dùng dịch pha loãng là nước muối sinh lý (NaCI 0,85 %), vô trùng, pH = 7, không chứa các hợp chất kali;
Lấy 9 ml dịch pha loãng cho vào các ốngnghiệm (6.2.5), đậy nút bông và khử trùng ở 121 °C không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2);
5.5 Môitrường nuôi cấy
5.5.1 Thành phần
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa hợp chất kali khó tan, ví dụ như môi trường Aleksandrov (cải tiến) có thành phần như sau:
Tinh bột tan (C6H10O5)n) | 20,0 g |
Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7 H2O) | 0,5 g |
Sắt (III) clorua (FeCI3) | 0,005 g |
Canxi cacbonat (CaCO3) | 0,1 g |
Canxi (II) phosphat (Ca3(PO4)2) | 2,0 |
Khoáng vật chứa kali (fenspat (KAISi3O8)), qua rây 0,2 mm | 5,0 g |
Nước cất vừa đủ | 1000 ml |
pH | 6,5 |
CHÚ THÍCH 2: Nếu môitrường thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch.
5.5.2 Cách chuẩn bị
Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã liệt kê tại (5.5.1).
5.5.2.1 Môi trường dịch thể
Phân phối 100 ml môi trường (5.5.2) vào bình tam giác dungtích 250 ml(6.2.1),đậynútbông,khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1.2).
5.5.2.2 Môi trường thạch đĩa
Phân phối 200 ml môi trường (5.5.2) vào bình tam giác dungtích 500 ml(6.2.1),đậynútbông,khửtrùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1.2), làm nguội đến 50 °C, phân phốilượng từ15 mlđến20 ml môi trường vào các đĩa Petri (6.2.4) đã chuẩn bị sẵn (6.3); các thao tác tiến hành trong tủ cấy vô trùng (6.1.1).
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và cụ thể như sau:
6.1 Thiết bị
6.1.1 Tủ cấy vô trùng (Box cấy), vận tốc dòng khí trung bình 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m3/h, màng lọc ULPA với kích thước hạt từ 0,1μm đến 0,3μm.
6.1.2 Nồi hấp áp lực, áp suất tối thiểu 101,3 kPa, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 °C.
6.1.3 Tủ sấy, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 40 °C đến 260 °C.
6.1.4 Tủấm, có khả năng duy trìnhiệt độ từ 20 °Cđến 60 °C.
6.1.5 Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ 150 r/min, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 20 °C đến 40 °C.
6.1.6 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,0001 g.
6.1.7 Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.
6.1.8 Máy trộn Vortex, tốc độ 1000 r/min.
6.1.9 Máy ly tâm, tốc độ 6000 r/min.
6.1.10 Máy đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.
6.1.11 Máy quang kế ngọn lửa, đánh lửa điện tử, sử dụngcácloạikhí prôpan,butan,khí tự
nhiên, hoặc khí hóa lỏng; Thang đo từ 0 ppm đến 199,9 ppm; Ngưỡng pháthiện:K ≤ 2 ppm.
6.2 Dụng cụ
6.2.1 Bình tam giác, dung tích 250 ml, 500 ml.
6.2.2 Cốc thuỷtinh, dung tích 100 ml và 1000 ml.
6.2.3 Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 250 ml, 1000 ml.
6.2.4 Đĩa Petri, đường kính 90 mm.
6.2.5 Ống nghiệm, kích thước 18 mm x 180 mm.
6.2.6 Que cấy vòng.
6.2.7 Que gạt mẫu (bàn trang)
6.2.8 Pipet (Micropipet), có thể lấy các thể tích 0,1 ml và 1 ml.
6.3 Chuẩn bị dụng cụ
-Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được rửa sạch, tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây:
+ Khử trùng khô: Giữ ở nhiệt độ 180 °C không ít hơn 1h trong tủ sấy (6.1.3) hoặc;
+ Khử trùng ướt: Giữ ở nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2).
-Dụng cụ sử dụng trong định lượng kali hòa tan phải được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất.
7.1 Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là đại diện và mẫu không bị hư hỏng hoặc suy giảm chất lượng trong quá trình bảo quản và vận chuyển.
7.2 Chuẩn bị mẫu
Lấy một vòng que cấy vi sinh vật cấy vào bình tam giác chứa môi trường dịch thể đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.1). Nuôi lắc ở tốc độ 150 r/min, trong thời gian từ 2 ngày đến 3 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C; đảm bảo mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 108 CFU/ml (dung dịch mẫu ban đầu).
8 Định tính khả năng hòa tan kali của vi sinh vật
8.1 Cách tiến hành
Dùng một pipet vô trùng lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (5.4), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, trộn đều bằng máy trộn Vortex (6.1.8) để có dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục pha loãng để đạt được độ pha loãng 10-5, 10-6;
Dùng một pipet vô trùng khác lấy 0,1 mldung dịch mẫu pha loãng cấy vào đĩa Petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.2). Mỗi nồng độ pha loãng được cấy lặp lại không ít hơn 2 đĩa Petri;
Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch mẫu thấm đều trên bề mặt thạch, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa Petri, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C trong thời gian từ 5 đến 7 ngày;
Quan sát vòng trong bao quanh khuẩn lạc.
CHÚ THÍCH 3: Sau khi nuôi cấy, các đĩa Petri có thể được để lạnh ở 4 °C trong thời gian 24 h để vòng phân giải hiện rõ.
8.2 Khẳng định
Vi sinh vật có khả năng hòa tan kali là vi sinh vật tạo được vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc.
9 Định lượng khả năng hòa tan kali của vi sinh vật
9.1 Cách tiến hành
9.1.1 Mẫu thử
Lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào bìnhtam giác chứa 100 ml môi trường dịch thể đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.1). Nuôi lắc ở tốc độ 150 r/min, trong thời gian từ 5 ngày đến 7 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C; đảm bảo mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 108CFU/ml (dung dịch mẫu thử). Mỗi mẫu được cấy lặp lại không ít hơn 3 lần;
Ly tâm không ít hơn 1,5 ml dung dịch mẫu thử bằng máy ly tâm (6.1.9) với tốc độ 6000 r/min, trong thời gian 10 min;
Lấy 1,0 ml phần dung dịch trên bề mặt (phầndung dịch trong) cho vào bình định mức dung tích 50 ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều;
Xác định lượng kali hòa tan trong mẫu thử bằng máy quang kế ngọn lửa.
9.1.2 Mẫu trắng
Ly tâm không ít hơn 1,5 ml môi trường dịch thể đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.1) bằng máy ly tâm (6.1.9) với tốc độ 6000 r/min, trong thời gian 10 min;
Lấy 1,0 ml phần dung dịch trên bề mặt (phần nước trong) cho vào bình định mức dung tích 50 ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều;
Xác định lượng kali hòa tan trong mẫu trắng bằng máy quang kế ngọn lửa.
CHÚ THÍCH 4: Tiến hành đo dung dịch mẫu thử và mẫu đối chứng đồng nhất với điều kiện đo dung dịch chuẩn. Sau khi đo khoảng 10 mẫu phải kiểm tra lại thang chuẩn. Nếu sai lệch phải hiệu chỉnh máy, lập lại đường chuẩn và đo lại mẫu.
9.2 Tính và biểu thịkết quả
Hàm lượng K2O hòa tan do vi sinh vật giải phóng ra được tính theo công thức:
(mg/l)
Trong đó:
M Hàm lượng K2O hòa tan do vi sinh vật giải phóng ra,tính bằng miligam/lít (mg/l);
a Hàm lượng K+trong mẫu thử, tính bằng miligam/lít (mg/l);
ao Hàm lượng K+ trong mẫu trắng, tính bằng miligam/lít(mg/l);
50 Thể tích bình định mức, tính bằng mililit (ml);
1 Lượng mẫu thử, tính bằng mililit (ml);
1000 Hệ số quy đổi từ lít sang mililít;
1,205 Hệ số quy đổi từ K+ sang K2O.
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:
-Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
-Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
-Tất cả các thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
-Các kết quả thử nghiệm thu được;
-Nếu độ lặp lại được kiểm tra, thìnêu kết quả cuối cùng thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Archana D. S. 2007. Studies on potassium solubilizing bacteria. Master of Science(agriculture). University of Agricultural Sciences, Dharwad
[2] Sugumaran, P. and Janarthanam, B., 2007, Solubilization of potassium containing minerals by bacteria and their effect on plant growth. World J. Agric. Sci., 3(3): 350-355.
[3] TCVN 8560:2010. Phân bón - Phương pháp xác định kali hữu hiệu.