TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 10489 : 2014
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LASALOCID BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG
Animal feeding stuffs - Determination of lasalocid content by spectroflurometric method
Lời nói đầu
TCVN 10489:2014 được xây dựng dựa theo AOAC 975.61 Lasalocid in Feeds. Spectrofluorometric Method;
TCVN 9907:2014 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LASALOCID BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG
Animal feeding stuffs - Determination of lasalocid content by spectroflurometric method
1.Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đo huỳnh quang để xác định hàm lượng lasalocid trong thức ăn chăn nuôi.
2.Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6952 (ISO 6498), Thức ăn chăn nuôi- Chuẩn bị mẫu thử.
3.Nguyên tắc
Chiết lasalocid ra khỏi dung dịch pH 4,7 bằng etyl axetat, xử lý lần lượt bằng axit và kiềm để loại các tạp chất phát huỳnh quang. Thực hiện đo huỳnh quang hợp chất thu được, hiệu chỉnh độ phát huỳnh quang không đặc trưng bằng cách tạo phức với axit boric (H3BO3). Monensin và ethoxyquin không gây nhiễu đến phép xác định.
4.Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.
4.1. Dung dịch đệm axetat, pH 4,7
Hòa tan 5,0 g natri axetat (NaCH3COO) trong khoảng 50 ml nước, dùng axit axetic (CH3COOH) để chỉnh pH đến 4,7 và thêm nước đến 100 ml.
4.2.Etyl axetat (CH3COOC2H5), không phát huỳnh quang.
4.3.Dung dịch axit boric trong metanol
Hòa tan 20,0 g axit boric trong metanol và thêm metanol đến 500 ml. Chuẩn bị dung dịch trong ngày sử dụng.
4.4.Dung dịch chuẩn natri lasalocid
4.4.1.Dung dịch chuẩn I, 0,24 μg/ml
Hòa tan 30,0 mg chất chuẩn natri lasalocid trong etyl axetat và thêm etyl axetat đến 100 ml. Dùng pipet lấy 4 ml cho vào bình định mức 100 ml, thêm etyl axetat đến vạch và trộn. Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch thu được cho vào ống ly tâm 50 ml có nắp đậy bằng thủy tinh có chứa sẵn 2,4 ml dung dịch đệm pH 4,7. Lắc trên máy lắc cơ học từ 25 min đến 30 min và ly tâm 10 min ở tốc độ 2 000 r/min. Dùng pipet lấy 2 ml dịch chiết trong cho vào bình định mức 100 ml, thêm etyl axetat đến vạch và trộn.
4.4.2.Dung dịch chuẩn II
Dùng pipet lấy 2 ml dịch chiết trong (xem 4.4.1) cho vào bình định mức 100 ml có chứa 10 ml dung dịch axit boric trong metanol (4.3), thêm etyl axetat đến vạch và trộn.
4.5.Dung dịch axit clohydric, 1,5 M.
4.6.Dung dịch natri hydroxit, 40 % (khối lượng/thể tích).
4.7.Natri sulfat (Na2SO4), khan.
5.Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây:
5.1.Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
5.2.Máy nghiền phòng thử nghiệm.
5.3.Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 70 °C.
5.4.Máy lắc cơ học.
5.5.Ống ly tâm có nắp đậy bằng thủy tinh, dung tích 50 ml.
5.6.Máy ly tâm, có thể vận hành ở tốc độ 2 000 r/min.
5.7.Dao trộn hoặc đũa thủy tinh.
5.8.Pipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.
5.9.Bình định mức, dung tích 100 ml và 500 ml.
5.10.Máy đo phổ huỳnh quang, có thể đo ở bước sóng kích thích 310 nm và bước sóng phát xạ 419 nm. Kiểm tra máy đo theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
5.11.Cuvet thạch anh, có chiều dài đường quang 1 cm.
6.Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thửnghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497)[1]
7.Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).
Nghiền 200 g mẫu thức ăn chăn nuôi không phải dạng premix (cám, dạng viên hoặc dạng vụn) cho lọt qua sàng số 30 và trộn đều.
8.Cách tiến hành
8.1.Chiết mẫu
8.1.1.Đối với thức ăn chăn nuôi
Cân chính xác khoảng 4 g phần mẫu thử đã chuẩn bị theo Điều 7, cho vào ống ly tâm 50 ml có nắp đậy bằng thủy tinh (5.5) có chứa 2,4 ml dung dịch đệm axetat pH 4,7 (4.1). Vặn nắp và lắc nhanh ống bằng tay để dung dịch đệm thấm ướt đều mẫu thử. Ngâm ống khoảng 4 min đến 5 min trong nồi cách thủy (5.3) ở 70 °C. Làm nguội đến nhiệt độ phòng và dùng pipet thêm 25 ml etyl axetat (4.2).
Đậy nắp ống và trộn ngay bằng cách lắc mạnh để hòa tan mẫu thử. Nếu cần, làm vỡ các cục vón bằng dao trộn hoặc đũa thủy tinh (5.7). Đậy nắp ống và cho lắc trên máy lắc (5.4) khoảng 25 min đến 30 min sau đó cho ly tâm 10 min với tốc độ 2 000 r/min.
Dùng pipet lấy 15 ml dịch chiết trong suốt cho vào ống ly tâm 50 ml (5.5). Thêm 2 ml dung dịch axit clohydric 1,5 M (4.5) và lắc 10 min sau đó cho ly tâm 10 min với tốc độ 2 000 r/min. Dùng pipet lấy 10 ml dịch chiết trong cho vào ống ly tâm 50 ml khác có nắp đậy bằng thủy tinh (5.5) và thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxit 40 % (4.6). Lắc ngay bằng tay, thêm 2 g natri sulfat khan (4.7) và lắc lại. Cho ly tâm 10 minở 2 000 r/min. Nếu dung dịch etyl axetat không trong hoặc có hạt nhỏ nổi trên bề mặt thì xoay nhẹ ống bằng tay và cho ly tâm lại.
Dùng pipet lấy 2 ml lớp etyl axetat trong ống ly tâm cho vào bình định mức 100 ml (5.9) mà không làm xáo trộn dung dịch kiềm, pha loãng đến vạch bằng etyl axetat (4.2) và trộn (được coi là dung dịch thử I).
Dùng pipet lấy thêm 2 ml lớp etyl axetat trong ống ly tâm cho vào bình định mức 100 ml (5.9) thứ hai có chứa 10 ml dung dịch axit boric trong metanol (4.3), thêm etyl axetat (4.2) đến vạch và trộn (được coi là dung dịch thử II).
8.1.2.Đối với premix
Cân chính xác khoảng 2,00 g premix 15 % và chuyển sang bình định mức 500 ml (5.9). Thêm chính xác 250 ml etyl axetat (4.2) và lắc 25 min trên máy lắc cơ học (5.4). Cho ly tâm một lượng và pha loãng bằng etyl axetat như trong 8.1.1 để có được dung dịch thử I và dung dịch thử II có chứa nồng độ natri lasalocid khoảng 0,24 μg/ml trong etyl axetat. Tiến hành các phép đo huỳnh quang như trong 8.3.
CHÚ Ý: Bỏ qua công việc xử lý với chất đệm pH 4,7 cho cả premix và chất chuẩn.
8.2.Dung dịch mẫu trắng thuốc thử
8.2.1.Đối với thức ăn chăn nuôi
Dùng pipet lấy 25 ml etyl axetat (4.2) cho vào ống ly tâm 50 ml có nắp đậy bằng thủy tinh (5.5) có chứa2,4 ml dung dịch đệm axetat pH 4,7 (4.1). Tiếp tục thực hiện theo 8.1.1, bắt đầu từ "Đậy nắp ống và trộn ngay bằng cách lắc mạnh..." để thu được dung dịch mẫu trắng thuốc thử I và dung dịch mẫu trắng thuốc thử II.
8.2.2.Đối với premix
Thực hiện tương tự 8.1.2 nhưng không dùng mẫu thử để thu được dung dịch mẫu trắng thuốc thử I và dung dịch mẫu trắng thuốc thử II.
8.3.Phép xác định
Cài đặt các bước sóng kích thích và phát xạ của máy đo phổ huỳnh quang (5.10) ở mức tối đa. Điều chỉnh thiết bị bằng các dung dịch chuẩn I (4.4.1) trong cuvet (5.11) hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất đến số đọc 0,400 μA. Kiểm tra điểm chuẩn này trước và sau mỗi lần đọc, sử dụng cùng một cuvet cho tất cả các số đọc đối chứng. Do có sự phân hủy bởi tia cực tím nên cần loại bỏ và thay dung dịch chuẩn I sau mỗi lần đọc thứ hai.
Đo huỳnh quang ở bước sóng 419 nm theo thứ tự như sau: dung dịch thử I (8.1.1 hoặc 8.1.2), dung dịch chuẩn I (4 4.1). dung dịch trắng thuốc thử I (8.2.1 hoặc 8.2.2), dung dịch thử II (8.1.1 hoặc 8.1.2)dung dịch chuẩn II (4.4.2) và dung dịch trắng thuốc thử II (8.2.1 hoặc 8.2.2). Nếu số đọc của dung dịch chuẩn I bị lệch thì chỉnh về cài đặt ban đầu. Nếu lệch ra ngoài dải từ 0,393 đến 0,407 thì kiểm tra lại tất cả các số đọc của tất cả các dung dịch.
Cường độ huỳnh quang của chất chuẩn phải tuyến tính trong khoảng từ 0,12 μg/ml đến 0,48 μg/ml và nồng độ natri lasalocid trong dung dịch thử phải nằm trong khoảng ± 25 % của dung dịch chuẩn.
9.Tính kết quả
9.1.Đối với thức ăn chăn nuôi
9.1.1.Hàm lượng natri lasalocid trong mẫu thử, X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức (1) sau đây:
X = (1)
Trong đó:
U1là cường độ huỳnh quang của dung dịch thử I (xem 8.1.1);
U2là cường độ huỳnh quang của dung dịch thử II (xem 8.1.1);
S1là cường độ huỳnh quang của dung dịch chuẩn I (4.4.1);
S2 là cường độ huỳnh quang của dung dịch chuẩn II (4.4.2);
R1là cường độ huỳnh quang của dung dịch trắng thuốc thử I (xem 8.2.1);
R2 là cường độ huỳnh quang của dung dịch trắng thuốc thử II (xem 8.2.1);
D là hệ số pha loãng (D = 25 x 100/2 = 1250);
S là nồng độ của natri lasalocid có trong dung dịch chuẩn I (S = 0,24 μg/ml);
W là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
0,96 là độ thu hồi.
9.1.2.Khi S = 0,24 μg/ml, W = 4,00 g, và R1 = R2 = 0,
Hàm lượng natri lasalocid tính bằng phần trăm khối lượng mẫu thử, được tính theo công thức (2) sau đây:
(2)
9.2.Đối với premix
9.2.1.Hàm lượng natri lasalocid trong mẫu thử, X, tính bằng phần trăm khối lượng, được tính theo công thức (3) sau đây:
X = (3)
Trong đó:
U1, U2, S1, S2, R1, R2, S, Wnhư trong 9.1.1;
Dlà hệ số pha loãng (250 x 50 x 50 x 100/5 x 5 x 2 = 1 250 000).
9.2.2.Khi S = 0,24 μg/ml, W = 2,00 g và R1 = R2 = 0,
Hàm lượng natri lasalocid trong premix 15 %, được tính theo công thức (4) sau đây:
(4)
10.Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) Phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) Tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) Kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu