THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HALOFUGINONE - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuffs - Determination of halofuginone content - Method using high-performance liquid chromatography
Lời nói đầu
TCVN 10330:2014 được xây dựng dựa theo Commission regulation (EC) No. 152/2009;
TCVN 10330:2014 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HALOFUGINONE - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuffs - Determination of halofuginone content - Method using high-performance liquid chromatography
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng halofuginone (DL-trans-7-bromo-6-chloro- 3- [3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-one hydrobromide) trong thức ăn chăn nuôi sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Giới hạn định lượng của phương pháp là 1 mg/kg.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.
Sau khi xử lý mẫu bằng nước nóng, halofuginone được tách ra dưới dạng bazơ tự do vào ethyl axetat và sau đó tách phân đoạn dưới dạng hydroclorua vào dung dịch axit. Chất chiết được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion. Hàm lượng halofuginone được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector UV.
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.
4.1. Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
4.2. Nhựa Amberlite XAD-2.
4.3. Amoni axetat.
4.4. Etyl axetat.
4.5. Axit axetic băng.
4.6. Chất chuẩn halofuginone (DL-trans-7-brome-6-chloro-3-[3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl] quinazoline-4-(3H)-one hydrobromide, E 764).
4.6.1. Dung dịch chuẩn gốc halofuginone, 100 mg/ml
Cân 50 mg chất chuẩn halofuginone, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 500 ml, hòa tan trong dung dịch đệm amoni axetat (4.18), thêm dung dịch đệm đến vạch và trộn. Dung dịch này nếu được bảo quản nơi tối ở 5 °C có thể bền được ba tuần.
4.6.2. Dung dịch hiệu chuẩn
Chuyển 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml và 6,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.6.1) vào một loạt các bình định mức 100 ml. Thêm pha động (4.21) đến vạch và trộn. Các dung dịch này có nồng độ halofuginone tương ứng là 1,0 mg/ml, 2,0 mg/ml, 3,0 mg/ml, 4,0 mg/ml và 6,0 mg/ml. Cần chuẩn bị các dung dịch này ngay trước khi sử dụng.
4.7. Axit clohydric (r20 xấp xỉ 1,16 g/ml).
4.8. Metanol.
4.9. Bạc nitrat.
4.10. Natri ascorbat.
4.11. Natri cacbonat.
4.12. Natri clorua.
4.13. EDTA (muối dinatri của axit ethylenediaminetetraacetic).
4.14. Nước, loại dùng cho HPLC.
4.15. Dung dịch natri cacbonat, c = 10 g/100 ml.
4.16. Dung dịch natri cacbonat bão hòa natri clorua, c = 5 g/100 ml.
Hòa tan 50 g natri cacbonat (4.11) trong nước, thêm nước đến 1 lít và thêm natri clorua (4.12) cho đến khi dung dịch bão hòa.
4.17. Dung dịch axit clohydric, xấp xỉ 0,1 mol/l.
Pha loãng 10 ml axit clohydric (4.7) trong nước đến 1 lít.
4.18. Dung dịch đệm amoni axetat, xấp xỉ 0,25 mol/l.
Hòa tan 19,3 g amoni axetat (4.3) và 30 ml axit axetic (4.5) trong nước (4.14) và pha loãng đến 1 lít.
4.19. Chuẩn bị nhựa amberlite XAD-2
Rửa một lượng thích hợp Amberlite (4.2) bằng nước cho đến khi loại hết tất cả các ion clorua, được kiểm tra bằng phép thử bạc nitrat (4.20) đối với nước rửa. Sau đó rửa nhựa với 50 ml metanol (4.8), loại bỏ metanol và bảo quản nhựa trong metanol mới.
4.20. Dung dịch bạc nitrat, xấp xỉ 0,1 mol/l.
Hòa tan 0,17 g bạc nitrat (4.9) trong 10 ml nước.
4.21. Pha động dùng cho HPLC
Trộn 500 ml axetonitril (4.1) với 300 ml dung dịch đệm amoni axetat (4.18) và 1200 ml nước (4.14). Chỉnh pH đến 4,3 bằng axit axetic băng (4.5). Lọc qua màng lọc 0,22 mm (5.8) và đuổi khí dung dịch (ví dụ bằng siêu âm 10 min). Dung dịch này nếu được bảo quản trong lọ kín để ở nơi tối có thể bền được 1 tháng.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1. Bể siêu âm.
5.2. Bộ cô quay.
5.3. Máy ly tâm.
5.4. Thiết bị HPLC, có detector UV bước sóng thay đổi hoặc detector mảng diod và có cột sắc ký lỏng, C18, pha đảo, kích thước 300 mm x 4 mm, cỡ hạt 10 mm hoặc loại tương đương.
5.5. Cột thủy tinh, kích thước 300 mm x 10 mm, được trang bị bộ lọc thủy tinh thiêu kết và có khóa.
5.6. Bộ lọc sợi thủy tinh, đường kính 150 mm.
5.7. Màng lọc, cỡ lỗ 0,45 mm.
5.8. Màng lọc, cỡ lỗ 0,22 mm.
5.9. Phễu chiết, dung tích 250 ml và 500 ml.
5.10. Cân, có thể cân chính xác đến 0,1 g.
5.11. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
5.12. Bình cầu đáy tròn, dung tích 250 ml.
5.13. Bình định mức, dung tích 10 ml, 100 ml và 500 ml.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498).
CHÚ THÍCH: Halofuginone dạng bazơ tự do không bền trong dung dịch kiềm và dung dịch etyl axetat. Do đó, không để halofuginone trong ethyl axetat quá 30 min.
8.1. Yêu cầu chung
8.1.1. Mẫu thử trắng cần được kiểm tra để chắc chắn rằng không có mặt halofuginone cũng như chất gây nhiễu.
8.1.2. Cần kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu thử trắng đã bổ sung halofuginone, với lượng tương tự dự kiến có trong mẫu. Bổ sung ở mức 3 mg/kg bằng cách thêm 300 ml dung dịch chuẩn gốc (4.6.1) vào 10 g mẫu thử trắng, trộn và đợi 10 min trước khi tiếp tục chiết (8.2).
CHÚ THÍCH: Mẫu thử trắng phải tương tự loại mẫu cần phân tích nhưng không phát hiện được halofuginone.
8.2. Chiết mẫu
Cân 10 g mẫu đã chuẩn bị, chính xác đến 0,1 g, cho vào ống ly tâm 200 ml, thêm 0,5 g natri ascorbat (4.10), 0,5 g EDTA (4.13), 20 ml nước và trộn. Đặt ống ly tâm vào nồi cách thủy (80 °C) trong 5 min.
Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 20 ml dung dịch natri cacbonat (4.15) và trộn. Thêm ngay 100 ml etyl axetat (4.4) và lắc mạnh bằng tay trong 15 s. Sau đó, đặt ống trong bể siêu âm (5.1) 3 min và nới lỏng nắp. Cho ly tâm trong 2 min và gạn pha etyl axetat qua bộ lọc sợi thủy tinh (5.6) vào phễu chiết 500 ml (5.9). Lặp lại việc chiết mẫu bằng 100 ml etyl axetat lần thứ hai. Rửa sạch phần dịch chiết đã gộp lại trong 1 min bằng 50 ml dung dịch natri cacbonat đã bão hòa natri clorua (4.16) và loại bỏ lớp nước.
Chiết lớp hữu cơ trong 1 min bằng 50 ml dung dịch axit clohydric (4.17). Cho lớp axit phía dưới chảy vào phễu chiết 250 ml (5.9). Chiết lại lớp hữu cơ trong 1,5 min bằng 50 ml axit clohydric tiếp theo (4.17) và gộp lại với dịch chiết thứ nhất. Rửa phần chiết đã gộp bằng cách xoay mạnh khoảng 10 s với 10 ml etyl axetat (4.4).
Chuyển định lượng lớp nước vào bình cầu đáy tròn 250 ml (5.12) và loại bỏ pha hữu cơ. Cho bay hơi hết etyl axetat còn lại ra khỏi dung dịch axit bằng bộ cô quay (5.2). Nhiệt độ của nồi cách thủy không được vượt quá 40 °C. Trong điều kiện chân không khoảng 25 mbar, tất cả etyl axetat còn lại sẽ được loại ra trong vòng 5 min ở 38 °C.
8.3. Làm sạch
8.3.1. Chuẩn bị cột Amberlite
Chuẩn bị cột XAD-2 cho mỗi lần chiết mẫu. Chuyển 10 g Amberlite đã chuẩn bị (4.19) vào cột thủy tinh (5.5) với metanol (4.8). Chèn một nút nhỏ bông thủy tinh lên trên lớp nhựa (resin). Xả metanol từ cột và rửa nhựa với 100 ml nước, ngắt dòng chảy khi chất lỏng đạt đến đỉnh của lớp nhựa. Để cột cân bằng trong 10 min trước khi sử dụng. Không để cột bị khô.
8.3.2. Làm sạch mẫu
Chuyển định lượng dịch chiết mẫu (8.2) lên cột Amberlite đã chuẩn bị (8.3.1) và rửa giải, gạn lấy chất rửa giải. Tốc độ rửa giải không được vượt quá 20 ml/min. Tráng bình cầu đáy tròn bằng 20 ml dung dịch axit clohydric (4.17) và sử dụng dung dịch axit clohydric này để rửa cột resin. Dùng dòng không khí để thổi hết dung dịch axit còn lại. Loại bỏ nước rửa. Thêm 100 ml metanol (4.8) vào cột và cho rửa giải từ 5 ml đến 10 ml, thu lấy dịch rửa vào bình cầu đáy tròn 250 ml (5.12). Để cho metanol còn lại cân bằng với resin trong 10 min và tiếp tục rửa giải với tốc độ không quá 20 ml/min. Thu lấy dịch rửa giải vào bình cầu đáy tròn trên. Cho bay hơi metanol trên thiết bị cô quay (5.2), nhiệt độ của nồi cách thủy không được vượt quá 40 °C. Chuyển định lượng phần còn lại bằng pha động (4.21) vào bình định mức 10 ml (5.13) đã được hiệu chuẩn. Thêm pha động đến vạch và trộn. Lọc một phần qua bộ lọc màng (5.7). Dùng dung dịch này cho phép xác định HPLC (8.4).
8.4. Phép xác định bằng HPLC
8.4.1. Các thông số
Các điều kiện sau được cung cấp để hướng dẫn, điều kiện khác có thể được sử dụng cung cấp mang lại kết quả tương đương.
- Cột sắc ký lỏng (5.4);
- Pha động dùng cho HPLC (4.21);
- Tốc độ dòng: từ 1,5 ml/min đến 2 ml/min;
- Bước sóng phát hiện: 243 nm;
- Lượng mẫu bơm: từ 40 đến 100 ml.
Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc ký, bơm vài lần dung dịch hiệu chuẩn (4.6.2) có chứa 3,0 mg/ml, cho đến khi đạt được chiều cao pic (hoặc diện tích) và thời gian lưu ổn định.
8.4.2. Đường chuẩn
Bơm mỗi dung dịch hiệu chuẩn (4.6.2) vài lần và đo chiều cao hoặc diện tích pic đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chuẩn từ chiều cao hoặc diện tích pic trung bình của các dung dịch hiệu chuẩn trên trục tung và nồng độ tương ứng tính bằng microgam trên trục hoành.
8.4.3. Dung dịch mẫu
Bơm dịch chiết mẫu (8.2) vài lần, sử dụng cùng một thể tích như đã thực hiện đối với các dung dịch hiệu chuẩn và xác định chiều cao (diện tích) trung bình của pic halofuginone.
Từ đường chuẩn (8.4.2), xác định nồng độ của dung dịch mẫu bằng microgam trên mililit theo chiều cao hoặc diện tích trung bình của các pic halofuginone của dung dịch mẫu thử.
Hàm lượng halofuginone có trong mẫu thử, w, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) được tính bằng công thức sau:
Trong đó:
c là nồng độ halofuginone trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);
10 là giá trị dung tích bình định mức, bằng thể tích dung dịch mẫu cuối cùng thu được sau khi làm sạch (xem 8.3.2), tính bằng mililit (ml);
m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).
10.1. Nhận biết
Có thể nhận biết chất phân tích bằng đồng sắc ký hoặc sử dụng detector mảng diod trong đó so sánh sắc phổ của dịch chiết mẫu và của dung dịch hiệu chuẩn (4.6.2) có nồng độ 6,0 mg/ml.
10.1.1. Đồng sắc ký
Chất chiết mẫu được bổ sung một lượng thích hợp dung dịch hiệu chuẩn (4.6.2). Lượng halofuginone được bổ sung phải tương tự với lượng halofuginone dự kiến tìm thấy trong chất chiết mẫu.
Chiều cao pic halofuginone phải tăng sau khi bổ sung chất chuẩn và cần tính đến độ pha loãng của dịch chiết. Chiều rộng pic tại điểm giữa chiều cao tối đa chỉ được dao động trong phạm vi ± 10 % chiều rộng tương ứng trước khi bổ sung.
10.1.2. Detector mảng diod
Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau:
a) bước sóng hấp thụ cực đại của mẫu và của phổ chuẩn, được ghi lại ở đỉnh pic trên sắc ký đồ, phải giống nhau trong một biên độ phụ thuộc vào khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diod, thường là trong vòng ± 2 nm;
(b) trong dải bước sóng từ 225 nm đến 300 nm, sắc ký đồ của mẫu và của chất chuẩn được ghi lại ở đỉnh pic trên sắc ký đồ, không được khác với những phần của phổ trong dải từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này được đáp ứng khi cùng có các cực đại như nhau và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của chất phân tích;
(c) trong dải bước sóng từ 225 nm đến 300 nm, phổ của đỉnh pic và độ dốc hai phía của pic thu được từ dịch chiết mẫu không được khác so với các phần quang phổ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này được đáp ứng khi cùng một cực đại có mặt và khi tất cả các điểm quan sát được có độ lệch giữa các phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của phổ cao nhất.
Nếu một trong các tiêu chí này không đáp ứng thì sự có mặt của chất phân tích không được xác nhận.
10.2. Độ lặp lại
Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá 0,5 mg/kg đối với hàm lượng halofuginone đến 3 mg/kg.
10.3. Độ thu hồi
Đối với các mẫu trắng thêm chuẩn, độ thu hồi ít nhất là 80 %.
11. Phép thử liên phòng thử nghiệm
Một nghiên cứu cộng tác[2] đã được tổ chức thực hiện trên ba mẫu, do tám phòng thử nghiệm tham gia.
Kết quả nghiên cứu cộng tác được nêu trong Bảng 1.
Bảng 1 - Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác
|
|
Mẫu A (trắng) khi mới nhận |
Mẫu B (dạng bột) |
Mẫu C (dạng viên) |
||
|
Mới nhận |
Sau hai tháng |
Mới nhận |
Sau hai tháng |
||
|
Giá trị trung bình [mg/kg] |
Không phát hiện |
2,80 |
2,42 |
2,89 |
2,45 |
|
Độ lệch chuẩn tái lập, SR [mg/kg] |
- |
0,45 |
0,43 |
0,40 |
0,42 |
|
Hệ số biến thiên tái lập, CVR [%] |
- |
16 |
18 |
14 |
17 |
|
Độ thu hồi [%] |
|
86 |
74 |
88 |
75 |
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử.
e) kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu
[2] Analytical Methods Committee (1983), Determination of halofuginone hydrobromide in medicated animal feed. Analyst, Vol. 108: 1252-1256