Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng axit oxolinic trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 mg/kg.
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp do Trung tâm Phát triển Thuỷ sản Ðông Nam á (SEAFDEC) biên soạn.
Axit oxolinic - kháng sinh thuộc nhóm Quinolon - trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng axetonitril. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với n-hexan bão hoà axetonitril. Hàm lượng axit oxolinic trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.
4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử
4.1 Thiết bị, dụng cụ
4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.
4.1.2 Cột sắc ký TSK - GEL ODS - 80 TM, L x ID : 150 x 4,6mm, kích thước hạt 5µm.
4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,4 µm.
4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút.
4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g.
4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút.
4.1.7 Bể siêu âm.
4.1.8 Hệ thống cô quay chân không.
4.1.9 ống ly tâm thuỷ tinh, dung tích 150 ml, 15ml.
4.1.10 Bình chiết dung tích 125 ml.
4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml.
4.1.12 Bình định mức dung tích 10 ml và 100 ml.
4.2 Hóa chất
4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC.
4.2.2 Axetonitril loại dùng cho HPLC.
4.2.3 Metanol loại dùng cho HPLC.
4.2.4 1 - propanol tinh khiết, loại dùng cho phân tích.
4.2.5 n - hexan tinh khiết, loại dùng cho phân tích.
4.2.6 Sulfat natri khan.
4.2.7 Clorua natri tinh khiết, loại dùng cho phân tích.
4.2.8. Axit xitric loại dùng cho HPLC.
4.2.9. Axit oxolinic loại dùng cho HPLC.
4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử
4.3.1 Axit xitric 0,1 M: hòa tan 21,01 g axit xitric (4.2.8) trong 1 lít nước cất (4.2.1).
4.3.2 Dung môi pha động: pha động cho tiến trình chạy HPLC là hỗn hợp của axetonitril, metanol và dung dịch axit xitric 0,1 M theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 3.
4.3.3 Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml: cân chính xác 10,0 mg axit oxolinic trên cân phân tích (4.1.5), hòa tan và định mức tới 100 ml bằng hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ về thể tích là 1 :1.
4.3.4 Dung dịch chuẩn trung gian 10 µg/ml: hút chính xác 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml (4.3.3) vào bình định mức 100 ml. Ðịnh mức tới vạch bằng hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ về thể tích là 1 :1.
4.3.5 Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác lần lượt 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.3.4) vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch bằng hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ về thể tích là 1 :1 để được các chuẩn có hàm lượng axit oxolinic lần lượt là: 0,2 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, 2,0 µg/ml, 5,0 µg/ml và 10,0 µg/ml.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Cân chính xác 5,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 150 ml (4.1.9). Thêm 25,0 ml axetonitril (4.2.2) và 10,0 g sulfat natri khan (4.2.6) rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Ly tâm trong vòng 5 phút ở tốc độ 2 500 vòng/phút.
5.1.2 Lọc lấy phần dịch cho vào bình chiết 125 ml (4.1.10) chứa sẵn 25,0 ml n-hexan bão hòa axetonitril.
5.1.3 Thêm 25,0 ml axetonitril vào phần bã trong ống ly tâm rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Ly tâm trong vòng 5 phút ở tốc độ 2 500 vòng/phút và lọc lấy phần dịch cho vào bình chiết ở trên (5.1.2).
5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có axit oxolinic. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.
5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
Thêm 2ml dung dịch chuẩn có hàm lượng 5 µg/ml vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.
5.4 Làm sạch dịch chiết
5.4.1 Lắc mạnh bình chiết thu được ở các Ðiều 5.1, 5.2 và 5.3 trong vòng 10 phút rồi để yên cho tách lớp. Mở khoá để chuyển lớp axetonitril ở dưới vào bình cầu thủy tinh 100 ml (4.1.11). Thêm 5,0 ml 1-propanol (4.2.4) vào trong bình rồi cô cạn trên máy cô quay chân không (4.1.8) ở nhiệt độ 40oC.
5.4.2 Thêm 2,0 ml (V) hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỷ lệ 3:7 về thể tích. Ðể bình vào trong bể điều nhiệt của bể siêu âm (4.1.7) cho đến khi hoà tan cặn hoàn toàn.
5.4.3 Chuyển dung dịch vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1.9). Thêm 100,0 mg clorua natri tinh khiết và 1,0 ml dung dịch n-hexan bão hòa axetonitril. Trộn đều trong bể siêu âm (4.1.7) và ly tâm trong vòng 5 phút ở tốc độ 2 500 vòng/phút.
5.4.4 Ðể yên cho tách lớp, sau đó dùng pipet cẩn thẩn hút lớp axetonitril ở dưới cho vào xilanh nhựa đã gắn sẵn màng lọc mao quản (4.1.3). Tiến hành phân tích dịch lọc thu được trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5.
5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC
5.5.1 Ðiều kiện phân tích
a. Cột sắc ký : TSK - GEL ODS 80 TM, L x ID:150 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.
b. Nhiệt độ cột : 35oC.
c. Pha động : Hỗn hợp axetonitril, metanol và axit xitric 0,1 M (4.3.2).
d. Tốc độ dòng : 0,5 ml/phút.
đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang: (kích hoạt) E x 337nm, (phát xạ) Em 365nm.
e. Thể tích tiêm : 20 µl.
5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.5) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ axit oxolinic theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).
5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui định tại Ðiều 5.4.4 vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích
5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm
Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
5.6.2 Ðộ thu hồi (R)
Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu đã cho vào một lượng dung dịch axit oxolinic chuẩn đã biết hàm lượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.
5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.
Hàm lượng axit oxolinic có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.2). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng axit oxolinic có trong mẫu được tính theo công thức sau:
C (µg/kg) = | (Y - b) | x F x 1 000 |
a |
Trong đó:
- C là nồng độ axit oxolinic có trong mẫu, tính theo µgkg.
- Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích
- a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.2.
- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V (5.4.2) và khối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng.