GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG BÀO NANG LÀ ĐỐI TƯỢNG KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM
The procedure of identification for cyst Nematodes - Plant Quarantine Pests of Vietnam
1. Phạm vi và đối tượng áp dụng
1.1. Phạm vi
Quy trình này áp dụng thống nhất trên phạm vi toàn quốc.
1.2. Đối tượng
Quy trình này áp dụng cho việc giám định tuyến trùng bào nang thuộc danh mục đối tượng KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 117/2000/QĐ-BNN-BVTV ngày 20/11/2000 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
1. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731 - 89 “Kiểm dịch thực vật - Phương pháp lấy mẫu”, 1989.
2. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3937 - 2000 “Kiểm dịch thực vật - Thuật ngữ và Định nghĩa”, 1999.
3. Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 336 - 98 “Kiểm dịch thực vật - Phương pháp kiểm tra củ, quả xuất, nhập khẩu và quá cảnh”, 1998.
4. Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 337 - 98 “Kiểm dịch thực vật - Phương pháp kiểm tra các loại hạt xuất, nhập khẩu và quá cảnh”, 1998.
5. Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 336 - 98 “Kiểm dịch thực vật - Phương pháp kiểm tra cây xuất, nhập khẩu và quá cảnh”, 1998.
Trong tiêu chuẩn này những thuật ngữ dưới đây được hiểu như sau:
3.1. Đối tượng kiểm dịch thực vật là loài sinh vật có tiềm năng gây tác hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp.
3.2. Thực vật là cây và những bộ phận của cây còn sống bao gồm cả hạt giống.
3.3. Vật thể thuộc diện kiểm dịch thực vật là thực vật, sản phẩm thực vật, phương tiện sản xuất, bảo quản, vận chuyển hoặc những vật thể khác có khả năng mang đối tượng kiểm dịch thực vật.
3.4. Dịch hại thực vật là loài, dòng, dạng sinh học của thực vật, động vật hoặc tác nhân gây hại cho thực vật hoặc sản phẩm thực vật.
3.5. Lô vật thể là một lượng nhất định của vật thể có các điều kiện và yếu tố giống nhau về khả năng nhiễm dịch.
3.6. Mẫu là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra theo một qui tắc nhất định.
3.7. Mẫu ban đầu là khối lượng mẫu thực vật, sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra từ một vị trí trong lô vật thể.
3.8. Mẫu chung là mẫu gộp các mẫu ban đầu.
3.9. Mẫu trung bình là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy từ mẫu chung theo một qui tắc nhất định, dùng để làm mẫu lưu và mẫu phân tích.
3.10. Mẫu phân tích là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc đất được dùng để phân tích tuyến trùng trong phòng thí nghiệm.
3.11. Tiêu bản là mẫu vật điển hình tiêu biểu của tuyến trùng bào nang được dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và bảo tàng.
3.12. Tuyến trùng bào nang là loài tuyến trùng ký sinh thuộc Họ phụ Heteroderinae, Họ Heteroderidae, Bộ Tylenchida. Trong quá trình phát triển, tuyến trùng cái phình to dần thành hình cầu, hình quả lê hoặc hình hạt chanh. Đẻ trứng ngay trong cơ thể, đến thời điểm nhất định, tuyến trùng cái chết trở thành bào nang bảo vệ trứng trước tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh.
4. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu
4.1. Thu thập mẫu
- Đối với thực vật, sản phẩm thực vật xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo phương pháp của tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731 - 89: Kiểm dịch thực vật - Phương pháp lấy mẫu.
- Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo Phương pháp của Tiêu chuẩn ngành số 10 TCN 224 - 2003.
4.2. Bảo quản mẫu
- Mẫu rễ và củ thu được để trong các túi polyethylen bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 - 10oC hoặc ở nhiệt độ phòng.
- Mẫu đất thu được để khô tự nhiên ở điều kiện nhiệt độ phòng hoặc sấy ở nhiệt độ 35 - 40oC cho đến khi đất khô để bào nang dễ dàng tách rời khỏi đất.
5. Phương pháp tách lọc tuyến trùng và làm tiêu bản giám định
5.1. Tách tuyến trùng bào nang ra khỏi đất và rễ
5.1.1. Tách tuyến trùng bào nang ra khỏi đất: Có ba phương pháp tách lọc tuyến trùng ra khỏi đất.
5.1.1.1. Lọc qua giấy Buhr: khối lượng mẫu đất từ 5 - 100gam.
- Cho đất vào cốc chứa 0,5 lít nước, cho thêm vào 3 - 5 giọt dung dịch kiềm bão hoà (NaOH hoặc KOH), khuấy đều.
- Đổ hỗn hợp dịch qua rây có đường kính mắt lỗ 2mm để lọc đá, rác.
- Lấy giấy lọc cuốn xung quanh mặt trong của cốc thuỷ tinh sao cho hai mép giấy chồng lên nhau 1 cm, đổ dịch lọc vào rồi khuấy đều theo một chiều trong 3 phút sau đó dừng lại cho bào nang bám vào mép trên giấy lọc.
- Lấy giấy lọc ra và quan sát trực tiếp bào nang hoặc rửa giấy lọc vào một cốc nước sạch rồi đổ nước đó lên rây có đường kính mắt lỗ 0,05 - 0,1 mm, quan sát bằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần (10 X).
5.1.1.2. Dùng dung dịch NaCl: khối lượng mẫu đất từ 10 - 100gam.
- Pha dung dịch NaCl ở nồng độ 10%.
- Cho đất vào dung dịch NaCl trên, khuấy đều cho bào nang nổi lên.
- Đổ hỗn hợp dịch nói trên qua rây có đường kính mắt lỗ 2mm để lọc đá, rác.
- Đổ hỗn hợp dịch trên qua rây có đường kính mắt lỗ 0,05 - 0,1 mm để giữ lại bào nang.
- Quan sát bào nang thu được bằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần (10X).
5.1.1.3. Dùng bình lọc Fenwick (hình 1): khối lượng mẫu đất từ 100 - 250 gam.
Hình 1. Bình Fenwick để tách bào nang trong đất
Ghi chú:
1. Mẫu đất giám định 6. Máng thu bào nang
2. Phễu lọc 7. Đường ra của máng thu bào nang
3. Bình lọc 8. Rây thu bào nang
4. Đáy phễu lọc 9. Đáy bình lọc
5. Vòi nước 10. Vòi bình
- Đổ đất vào rây có đường kính mắt lỗ 2mm, xối nước trực tiếp vào đất để đất tan vào bình cho đến khi lượng nước gần đầy bình, loại bỏ phần cặn trên rây.
- Mở vòi bình lọc với tốc độ chảy vừa phải sao cho các hạt đất tiếp tục chìm xuống còn bào nang nổi lên trên mặt nước và tràn qua miệng bình theo một máng dẫn xuống rây thu bào nang có đường kính mắt lỗ 0,05 - 0,1 mm phía dưới.
- Hong khô rây thu bào nang rồi quan sát và đếm.
5.1.2. Tách tuyến trùng bào nang ra khỏi rễ:
- Rửa rễ dưới vòi nước, thu phần nước rửa và lọc qua rây có đường kính mắt lỗ 0.05 - 0,1 mm. Hong khô rây và đưa lên kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 40 - 70 lần để quan sát và đếm bào nang.
- Cắt rễ đã rửa, ngâm trong đĩa petri có chứa nước. Sau 24giờ, đưa đĩa petri lên kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 40 - 70 lần để quan sát bào nang tuyến trùng.
5.2. Làm tiêu bản lỗ hậu môn của tuyến trùng:
- Ngâm tuyến trùng bào nang đã tách lọc trong nước 24giờ.
- Vớt ra, quan sát dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 40 - 70 lần và dùng dao lam cắt lấy phần thân có hậu môn (xem hình 2).
Phần bỏ đi |
Phần thân có hậu môn |
- Đặt phần thân có hậu môn lên lam kính, nhỏ vài giọt glyxerin để quan sát dưới kính hiển vi.
6. Trình tựgiám định
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi các chỉ tiêu sau
- Hình dạng và đo chiều dài kim hút, đếm số vòng ở vùng môi, quan sát gai giao hợp và đuôi của tuyến trùng đực.
- Hình dạng và đo kích thước của tuyến trùng cái.
- Hình dạng và đo kích thước trứng.
- Màu sắc, nếp nhăn hoặc các đường vân, vị trí lỗ sinh dục của bào nang.
- Đặc điểm lỗ hậu môn.
7. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của tuyến trùng bào nang ánh vàng khoai tâyHeterodera rostochiensis Wollenweber và tuyến trùng bào nang khoai tâyHeterodera pallida Stone được trình bày ở phụ lục 1.
8. Thẩm định kết quả giám định và báo cáo
Sau khi khẳng định kết quả giám định tuyến trùng bào nang là đối tượng kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải báo cáo Cục Bảo vệ thực vật (kèm phiếu kết quả giám định), đồng thời gửi tiêu bản hoặc mẫu tuyến trùng bào nang về Trung tâm Phân tích giám định và thí nghiệm KDTV để phúc tra .
Đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được tuyến trùng bào nang là đối tượng KDTV của Việt Nam phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Phân tích giám định và thí nghiệm KDTV để thẩm định trước khi ra quyết định công bố dịch và xử lý.
Đơn vị giám định phải lưu mẫu trong thời hạn ít nhất là 3 tháng để giải quyết khiếu nại kết quả giám định (nếu có).
Mẫu phiếu kết quả giám định như phụ lục 2.
1. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng bào nang ánh vàng khoai tây Heterodera rostochiensis Wollenweber - Đối tượng kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam.
- Con cái: Hình cầu, đường kính 0,5 - 0,8 mm
- Trứng: Hình bầu dục dài, kích thước 102 x 42 m
- Bào nang: Hình cầu, màu nâu đỏ, nhỏ như đầu đinh ghim, trên bề mặt có những đường vân do những chấm con hợp lại. Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn bé. Lỗ sinh dục nằm trên một giao điểm của các đường vân tạo thành hình chữ V (nhìn như mảnh vòng cung).
- Con đực: Hình giun, dài 1mm, kim hút khỏe, dài 27 - 28 m. Gốc chân kim hút nhỏ và tròn (hình 3). Đầu tuyến trùng thuôn múp, vùng môi có 6 - 8 vòng, có gai giao hợp, đuôi tròn ngắn.
2. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng bào nang khoai tây Heterodera pallida Stone - Đối tượng kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam.
- Con cái hình cầu, đường kính 0,5 - 0,8 mm
- Trứng hình bầu dục dài, kích thước 102 x 42 m
- Bào nang hình cầu, màu nâu, nhỏ như đầu đinh ghim, trên bề mặt có những đường vân do những chấm con hợp lại. Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn bé. Lỗ sinh dục nằm trên một giao điểm của các đường vân không tạo thành hình chữ V.
- Con đực hình giun, dài 1mm, kim hút khỏe, dài 27 - 28 m. Gốc chân kim hút to, thô và nhô về phía trước (hình 3). Đầu tuyến trùng thuôn múp, vùng môi có 6 – 8 vòng, có gai giao hợp, đuôi tròn ngắn.
Thân |
Heterodera pallida Stone Heterodera rostochiensis Wollenweber
Hình 3: Hình dạng kim hút của tuyến trùng bào nang
Heterodera rostochiensis Wollenwebervà Heterodera pallida Stone
Lưu ý: Thông thường, số lượng cá thể nghiên cứu phải đảm bảo là 30 (n = 30). Trong trường hợp số lượng cá thể ít hơn hoặc chỉ phát hiện được một cá thể tuyến trùng cái có các đặc điểm nhận dạng như trên cho phép kết luận là loài Heterodera rostochiensis Wollenweberhoặc Heterodera pallida Stone(chỉ áp dụng đối với các đơn vị đã từng giám định được tuyến trùng Heterodera rostochiensis Wollenweber hoặcHeterodera pallida Stone).
PHỤ LỤC 2
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
----------------------------------------
................., ngày... tháng ... năm 200...
PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH
TUYẾN TRÙNG BÀO NANG LÀ ĐỐI TƯỢNG KDTV CỦA VIỆT NAM
1. Tên lô hàng hoặc cây trồng:
2. Nước xuất khẩu hoặc địa điểm gieo trồng trong nước:
3. Nước xuất xứ:
4. Phương tiện vận chuyển: Khối lượng:
5. Địa điểm lấy mẫu:
6. Ngày lấy mẫu:
7. Người lấy mẫu:
8. Tình trạng mẫu hoặc cây trồng bị hại:
9. Ký hiệu mẫu:
10. Số mẫu lưu:
11. Người giám định:
12. Phương pháp giám định: Theo tiêu chuẩn ngành số 10 TCN 583- 2003 “Quy trình giám định tuyến trùng bào nang là đối tượng kiểm dịch thực vật của Việt Nam”
13. Kết quả giám định:
Tên khoa học:
Họ: Heteroderidae
Bộ: Tylenchida
Là đối tượng KDTV nhóm .... thuộc Danh mục đối tượng kiểm dịch thực vật của Việt Nam.
Thủ trưởng Đơn vị (Ký tên đóng dấu) | Trưởng phòng kỹ thuật (hoặc người giám định) |
1. Pháp lệnh Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật được công bố bởi Lệnh của Chủ tịch nước số 11/2001/LCTN ngày 08 tháng 08 năm 2001.
2. Điều lệ về kiểm dịch thực vật ban hành kèm theo Nghị định số 58/2002/NĐ-CP của Chính phủ ngày 03 tháng 06 năm 2002.
3. Đường Hồng Dật - Chủ biên (1996)
Từ điển bách khoa Bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
4. Viện Bảo vệ thực vật (1997)
Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, tập 1, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
5. Gooch , P.S; Siddiqui, M.R., Sheila, W., Mary Franklin (1973)
C.I.H. Desriptions of Plant – parasitic Nematodes, Commonwealth Institute of Helminthology st. Albans herts, England.
6. William, R. N. (1991)
Manual of Agricultural Nematology, E., Marcel Deker, Inc., New York.
7. Decker, H.H. (1969)
Phytonematologie - Biologie und Bekọmpfung Planzenparasitọrer Nematoden,Deutschcr Landwirtschaftsverlag - Berlin.