THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH RHODAMINE B BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Foodstuffs - Determination of rhodamine B by high performance liquid chromatography (HPLC)
Lời nói đầu
TCVN 8670:2011 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH RHODAMINE B BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Foodstuffs - Determination of rhodamine B by high performance liquid chromatography (HPLC)
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng rhodamine B trong các loại gia vị (bao gồm ớt bột, tương ớt, tương cà chua, gia vị có chứa ớt, cà chua ….) và hạt dưa bằng sắc ký lỏng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Rhodamine B được chiết ra khỏi mẫu bằng metanol rồi được định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector tử ngoại khả kiến hoặc detector màng diot ở bước sóng 556 nm hoặc detector huỳnh quang với bước sóng kích hoạt lex = 250 nm và bước sóng phát xạ lem = 550 nm.
Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc kí lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng phải là nước cất hai lần hoặc nước cất có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có các quy định khác.
3.1. Dung dịch chuẩn rhodamine B
3.1.1. Chất chuẩn rhodamine B, độ tinh khiết bằng hoặc lớn hơn 97 % khối lượng.
3.1.2. Dung dịch chuẩn gốc, 1000 mg/ml
Hòa tan 0,1 g chất chuẩn rhodamine B (3.1.1) trong metanol đựng trong bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng metanol đến vạch và trộn đều.
Dung dịch đã pha có thể ổn định trong 3 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 20C đến 40C.
3.1.3. Dung dịch chuẩn trung gian, 100 mg/ml
Dùng pipet lấy chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc (3.1.2) cho vào bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng metanol đến vạch.
Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.
3.1.4. Các dung dịch chuẩn làm việc, 0,1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml; 2,5 mg/ml và 5 mg/ml
Dùng pipet lấy chính xác 0,1 ml; 0,5 ml; 1 ml; 2,5 ml và 5 ml dung dịch chuẩn trung gian (3.1.3) lần lượt cho vào từng bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng metanol đến vạch.
Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.
3.2. Axetonitril
3.3. Metanol.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ cụ thể sau:
4.1. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao, gồm:
4.1.1. Cột phân tích HPLC C18, kích thước cột 250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt trung bình khoảng 5mm.
CHÚ THÍCH: Chiều dài và đường kính của cột có thể được thay đổi theo kỹ thuật sử dụng HPLC.
4.1.2. Detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS) hoặc detector màng diot (DAD), có thể đo ở bước sóng 556 nm hoặc detector huỳnh quang, có thể đo ở bước sóng kích hoạt lex = 250 nm và bước sóng phát xạ lem = 550 nm.
4.1.3. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao.
4.1.4. Bình chứa dung môi.
4.1.5. Hệ thống bơm mẫu.
4.1.6. Bộ tích phân, hoặc máy tính xử lý dữ liệu.
4.2. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,001 g.
4.3. Bể siêu âm
4.4. Máy li tâm, có thể li tâm ở tốc độ 6 000 r/min.
4.5. Bể ổn nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ 700C.
4.6. Máy lắc vortex.
4.7. Máy nghiền, có khả năng nghiền mẫu thử lọt qua rây có cỡ lỗ 0,5 mm.
4.8. Bình định mức, dung tích 100 ml.
4.9. Giấy lọc, loại trung tính, tốc độ chảy trung bình.
4.10. Ống li tâm, dung tích 50 ml.
4.11. Màng lọc, có cỡ lỗ 0,2 mm.
4.12. Bộ lọc dung môi, với màng lọc có cỡ lỗ 0,45 mm.
4.13. Rây, có cỡ lỗ 0,5 mm
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4889 (ISO 948) Gia vị - Lấy mẫu.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
6.1. Đối với mẫu gia vị dạng khô (ví dụ: bột ớt) và mẫu hạt dưa
Phần mẫu thử được lấy không nhỏ hơn 100 g. Đối với mẫu gia vị dạng bột thô hoặc mẫu hạt dưa, nghiền cẩn thận mẫu thử trong máy nghiền (4.7) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua rây có cỡ lỗ 0,5 mm (4.13). Trộn kỹ.
6.2. Đối với mẫu gia vị dạng sệt (ví dụ: tương ớt, tương cà chua)
Phần mẫu thử được lấy không nhỏ hơn 100 g, trộn kỹ cho đến khi đồng nhất.
7.1. Chiết mẫu
Cân từ 2 g đến 5 g phần mẫu thử đối với gia vị hoặc khoảng 0,5 g phần mẫu thử đối với hạt dưa đã chuẩn bị (Điều 6), chính xác đến 0,001 g, cho vào ống li tâm (4.10). Thêm khoảng 40 ml metanol (3.3.), đậy nắp, lắc trộn đều trong 1 min trên máy lắc vortex (4.6). Giữ ống li tâm trong bể ổn nhiệt (4.5) ở nhiệt độ 700C trong 1 h, sau đó giữ trong bể siêu âm (4.3) trong 5 min và li tâm bằng máy li tâm (4.4) với tốc độ 6 000 r/min trong 5 min. Gạn lấy phần lỏng trong ống li tâm cho vào bình định mức 100 ml (4.8). Phần bã được chiết lặp lại hai lần, mỗi lần dùng 30 ml metanol (3.3) và giữ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 700C trong 30 min. Gộp toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 100 ml ở trên. Thêm metanol (3.3) đến vạch. Lọc qua giấy lọc thô (4.9) rồi lọc tiếp qua màng lọc (4.11) trước khi bơm vào máy HPLC.
7.2. Điều kiện vận hành HPLC
Các thông số vận hành dưới đây được coi là thích hợp:
- pha động: axetonitril (3.2): nước = 75 : 25 (phần thể tích).
Lọc các dung môi pha dộng bằng bộ lọc dung môi (4.12) và loại bỏ khí hòa tan bằng cách giữ trong bể siêu âm khoảng 10 min trước khi sử dụng.
- detector: xem 4.1.2.
- thể tích bơm mẫu: 20 ml.
- tốc độ dòng: 1 ml/min.
- nhiệt độ buồng cột: 400C.
CHÚ THÍCH: Các thông số về tỷ lệ pha động, thể tích mẫu bơm, tốc độ dòng, nhiệt độ buồng cột có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.
7.3. Dựng đường chuẩn
Sau khi thiết bị cài đặt đã ổn định, tiến hành bơm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc (3.1.4), theo thứ tự từ nồng độ thấp đến nồng độ cao, mỗi dung dịch chuẩn bơm một lần.
Xác định diện tích hoặc chiều cao pic của các dung dịch chuẩn và dựng đường chuẩn.
7.4. Xác định
Bơm dung dịch mẫu thử với cùng điều kiện như bơm dung dịch chuẩn.
Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng rhodamine B trong dung dịch mẫu thử.
Nếu diện tích pic hoặc chiều cao pic của dung dịch mẫu thử lớn hơn diện tích pic hoặc chiều cao pic của dung dịch chuẩn cao nhất thì phải tiến hành pha loãng mẫu trong metanol và lặp lại quy trình phân tích.
Hàm lượng rhodamine B có trong mẫu, X, được biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau đây:
X = CM x
trong đó:
V là thể tích mẫu pha loãng cuối, tính bằng millit (ml) (trong trường hợp này là 100 ml);
CM là nồng độ rhodamine B trong dung dịch mẫu được bơm vào máy, tình bằng microgam trên mililit (mg/ml);
m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
K là hệ số pha loãng
Kết quả phân tích là giá trị trung bình của hai lần thử nghiệm độc lập.
Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, trong không quá 5 % các trường hợp lớn hơn 10 % giá trị trung bình của hai kết quả.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
- kết quả thử nghiệm thu được;
- nếu kiểm tra độ lặp lại, nêu kết quả cuối cùng thu được.
[1] Duane Lee (1989), Rhodamine B, Carcinogen And Pesticide Branch OSHA Analytical Laboratory Salt Lake City, Utah, USA.
[2] TCVN 4889 (ISO 948) Gia vị - Lấy mẫu.