TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Fish and fishery products - Determination of aflatoxin content - Method using high-performance liquid chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8350 : 2010 được xây dựng trên cơ sở AOAC 975.36 Aflatoxins in Food and Feeds. Romer Minicolumn Method;
TCVN 8350 : 2010 do Cục Chế biến, thương mại Nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,5 mg/kg.
Aflatoxin có trong mẫu thủy sản bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng cloroform. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel. Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với detector huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.
Chỉ sử dụng các thuốc thử và vật liệu tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Metanol, loại dùng cho HPLC.
3.2 Cloroform, loại dùng cho HPLC.
3.3 n-hexan.
3.4 Ete etylic.
3.5 Natri sulfat khan.
3.6 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin, gồm aflatoxin B1 (100,0 mg/l), aflatoxin B2 (20,0 mg/l), aflatoxin G1 (100 mg/l) và aflatoxin G2 (20 mg/l).
3.7 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin trong metanol, có nồng độ như 3.6
Chuẩn bị từ các ống chuẩn aflatoxin. Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng metanol (3.1) thích hợp.
3.8 Dung dịch chuẩn trung gian aflatoxin, gồm aflatoxin B1 (10,0 mg/l), aflatoxin B2 (2,0 mg/l), aflatoxin G1 (10,0 mg/l) và aflatoxin G2 (2,0 mg/l)
Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (3.6) vào bình định mức 10 ml (4.3) rồi định mức tới vạch bằng metanol (3.1).
3.9 Dung dịch chuẩn làm việc aflatoxin
Hút chính xác lần lượt 0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (3.8) vào các bình định mức 10 ml (4.3) rồi định mức tới vạch bằng metanol (3.1). Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau:
3.9.1 Dung dịch chuẩn 1, gồm aflatoxin B1 (0,0 mg/l), aflatoxin B2 (0,0 mg/l), aflatoxin G1 (0,0 mg/l), aflatoxin G2 (0,0 mg/l).
3.9.2 Dung dịch chuẩn 2, gồm aflatoxin B1 (1,0 mg/l), aflatoxin B2 (0,2 mg/l), aflatoxin G1 (1,0 mg/l), aflatoxin G2 (0,2 mg/l).
3.9.3 Dung dịch chuẩn 3, gồm aflatoxin B1 (2,0 mg/l), aflatoxin B2 (0,4 mg/l), aflatoxin G1 (2,0 mg/l), aflatoxin G2 (0,4 mg/l).
3.9.4 Dung dịch chuẩn 4, gồm aflatoxin B1 (4,0 mg/l), aflatoxin B2 (0,8 mg/l), aflatoxin G1 (4,0 mg/l), aflatoxin G2 (0,8 mg/l).
3.9.5 Dung dịch chuẩn 5, gồm aflatoxin B1 (8,0 mg/l), aflatoxin B2 (1,6 mg/l), aflatoxin G1 (8,0 mg/l), aflatoxin G2 (1,6 mg/l).
3.9.6 Dung dịch chuẩn 6, gồm aflatoxin B1 (10,0 mg/l), aflatoxin B2 (2,0 mg/l), aflatoxin G1 (10,0 mg/l), aflatoxin G2 (2,0 mg/l).
3.10 Dung dịch pha động
Pha hỗn hợp các dung môi axetonitril, metanol và nước theo tỉ lệ 2:2:6 (thể tích).
3.11 Silicagel đã hoạt hóa
Cân 50,0 g silicagel tinh khiết (cỡ hạt từ 60 mesh đến 200 mesh) để vào tủ sấy trong 2 h ở nhiệt độ 110 0C. Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong cloroform 15 min trước khi nhồi cột.
3.12 Bông thuỷ tinh.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Bình cầu thủy tinh, dung tích 100 và 250 ml.
4.3 Bình định mức, dung tích 5 và 10 ml.
4.4 Ống ly tâm thuỷ tinh, dung tích 250 ml.
4.5 Pipet.
4.6 Máy ly tâm, tốc độ 5 000 r/min.
4.7 Bể siêu âm.
4.8 Hệ thống cô quay chân không.
4.9 Màng lọc mao quản, kích thước 0,4 mm.
4.10 Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min.
4.11 Cột thủy tinh, có khóa teflon, loại dài 500 mm, đường kính trong 20 mm và loại dài 500 mm, đường kính trong 8 mm.
4.12 Cột sắc ký pha đảo LC18, dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, kích thước hạt từ 5 mm đến 10 mm, hoặc loại tương đương.
4.13 Hệ thống HPLC, được trang bị detector huỳnh quang.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Dùng cân phân tích (4.1) cân 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn, chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.4).
5.1.2 Thêm 100,0 ml cloroform (3.2) vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 min bằng máy nghiền (4.10). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.6) trong khoảng 5 min ở tốc độ 5 000 r/min. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng cloroform rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.2).
5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thủy sản đã được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1.
5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3 (3.9.3) vào 10,0 g mẫu trắng. Đồng nhất mẫu bằng máy nghiền (4.10). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1. Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng.
5.4 Làm sạch dịch chiết
5.4.1 Chuẩn bị cột
Đặt 1 lớp bông thủy tinh (3.12) vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon (4.11). Đóng khóa và cho cloroform tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g natri sulfat khan (3.5), 20,0 g silicagel đã hoạt hóa (3.11), 15,0 g natri sulfat khan (3.5).
Để tránh khô cột, luôn giữ mực cloroform cao hơn lớp natri sulfat khan trên cùng khoảng 1,5 cm.
5.4.2 Làm sạch dịch chiết
5.4.2.1 Cô dịch chiết thu được (5.1.2) trên hệ thống cô quay chân không (4.8) đến khi còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40 0C. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu (5.2) vào cột làm sạch đã chuẩn bị (5.4.1) và tráng rửa bình cầu bằng cloroform. Điều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 ml/min đến 1,5 ml/min. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel.
5.4.2.2 Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan (3.3), 50,0 ml ete etylic (3.4). Điều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 1,0 ml/min. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột.
5.3.2 Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp cloroform và metanol theo tỉ lệ 97:3 (thể tích) với tốc dộ 1,0 ml/min. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml (4.2). Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không (4.8) ở nhiệt độ 40 0C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V) dung dịch pha động (3.10) trong bình định mức 5 ml (4.3). Tiến hành phân tích hàm lượng các aflatoxin trên HPLC theo 5.5.
5.4.2.4 Tiến hành làm sạch mẫu trắng (5.2) và mẫu để xác định độ thu hồi (5.3) giống như với mẫu thử (5.1) theo 5.4.2.1, 5.4.2.2 và 5.3.2.
5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC
5.5.1 Điều kiện phân tích
– cột sắc ký: cột (4.12);
– nhiệt độ cột: 35 0C;
– pha động: hỗn hợp axetonitril, metanol và nước (3.10);
– tốc độ dòng: 1,0 ml/min;
– bước sóng cài đặt cho detector huỳnh quang: (kích hoạt) Ex 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm;
– thể tích tiêm: 20 ml.
5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn (3.9) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ axit oxolinic theo quan hệ tuyến tính.
Đường chuẩn phải có hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) lớn hơn hoặc bằng 0,99.
5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu thử, C, biểu thị bằng microgam trên kilogam (mg/kg) được tính theo công thức sau:
trong đó
Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích;
a là tung độ góc của đường chuẩn y = ax + b;
b là hệ số góc của đường chuẩn y = ax + b;
V là thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (xem 5.4.2), tính bằng mililit (ml).
M là khối lượng mẫu đã sử dụng (xem 5.1.1), tính bằng gam (g)
7.1 Độ lặp lại
Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS, tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
7.2 Độ thu hồi
Độ thu hồi của mẫu, R, được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng chính xác (5.3). Độ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.