TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
Fish and fishery products - Determination of tetracyclines residues- Method using high-performance liquid chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8349 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thônđề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định dư lượng kháng sinh nhóm tetracycline trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Phương pháp này có thể áp dụng để xác định các hợp chất: tetracyline (TC), oxytetracyline (OTC) và chlortetracyline (CTC)
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 mg/kg.
Các kháng sinh nói trên trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep-Pak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định bằng hệ thống HPLC với detector UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Metanol, loại dùng cho HPLC.
3.2 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol
Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm 2 phân tử nước bằng metanol (3.1) trong bình định mức 1 000 ml (4.2). Định mức tới vạch.
Dung dịch axit oxalic-metanol không bền, chỉ pha trước khi sử dụng.
3.4 Dung dịch đệm McIlvaine, pH 4,0 ± 0,05, chuẩn bị như sau:
Hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan bằng nước trong bình định mức dung tích 1 000 ml (4.2), định mức tới vạch, thu được dung dịch A.
Hoà tan 21,0 g axit xitric ngậm một phân tử nước bằng nước trong bình định mức (4.2), định mức tới vạch, thu được dung dịch B.
Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1 000 ml dung dịch B. Chỉnh pH tới 4,0 ± 0,05 bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1 M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1 M (sử dụng máy đo pH).
Dung dịch đệm McIlvaine bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.
3.5 Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA
Hoà tan 60,5 g dinatri etylendinitrilotetraaxetat (EDTA) ngậm 2 phân tử nước vào 1 625 ml dung dịch đệm Mcllvaine (3.4).
Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.
3.6 Pha động cho HPLC
Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm 2 phân tử nước bằng nước trong bình định mức 1 000 ml (4.2). Định mức tới vạch. Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril (3.2) và 166 ml metanol (3.1). Lọc và đuổi khí.
Dung dịch pha động không bền, chỉ pha trước khi sử dụng.
3.7 Các dung dịch chuẩn gốc tetracycline, 1 000 mg/ml
Cân 108 mg ± 0,1 mg mỗi loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC và CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi trong giấy chứng nhận) vào 3 bình định mức dung tích 100 ml (4.2) riêng biệt. Hòa tan và định mức tới vạch 100 ml bằng metanol (3.1).
Bảo quản các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc ở nhiệt độ -20 0C. Các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc bền trong vòng 3 tháng.
3.8 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp tetracycline, 100 mg/ml
Hút chính xác 10 ml các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc (3.7) vào bình định mức 100 ml (4.2). Định mức tới vạch bằng metanol (3.1).
3.9 Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp tetracycline, 25 mg/ml
Hút chính xác 2,5 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 100 mg/ml (3.8) vào bình định mức 10 ml (4.2). Định mức tới vạch bằng metanol (3.1).
Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 0C đến 5 0C. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần.
3.10 Dung dịch chuẩn hỗn hợp tetracycline, 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 và 1,00 mg/ml
Hút chính xác 20; 40; 100; 200 và 400 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 mg/ml (3.9) vào các bình định mức 10 ml (4.2). Thêm 6 ml dung dịch axit oxalic-metanol (3.3) vào mỗi bình. Định mức tới vạch bằng nước.
Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 0C đến 5 0C. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Bình định mức, dung tích 10; 100 và 1 000 ml.
4.3 Pipet, tự động điều chỉnh được từ 2 ml đến10 ml.
4.4 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 50 ml.
4.5 Xơranh thủy tinh, dung tích 100 ml.
4.6 Phễu Buchner, đường kính 5,5 cm.
4.7 Giấy lọc.
4.8 Dụng cụ đo pH.
4.9 Máy ly tâm, tốc độ 5 000 r/min, sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml.
4.10 Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min.
4.11 Bể siêu âm.
4.12 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml.
4.13 Cột sắc ký pha đảoC8, dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, kích thước hạt 5 mm.
4.14 Cột sắc ký pha đảoC18, dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, kích thước hạt 5 mm.
4.15 Hệ thống HPLC, được trang bị detector UV.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Cân 5,00 g ± 0,05 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh (4.4) thứ nhất. Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5) vào ống rồi nghiền trong 30 s bằng máy nghiền (4.10). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.9) trong 10 min ở tốc độ 3 000 r/min.
5.1.2 Gạn dịch trong của ống thứ nhất vào ống ly tâm thủy tinh (4.4) thứ 2. Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5) vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ nhất. Trộn đều, ly tâm ống trong 10 min ở tốc độ 3 000 r/min rồi lại gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2.
5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5) vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ nhất. Trộn đều rồi ly tâm ống trong 10 min ở tốc độ 3 000 r/min. Tiếp tục gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2.
5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 2 trong 20 min ở tốc độ 3 000 r/min. Sau đó, lọc dịch trong qua giấy lọc (4.7) trên phễu Buchner (4.6). Rửa ống ly tâm 2 lần, mỗi lần rửa sử dụng 2 ml dung dịch đệm McIlvaine – EDTA (3.5).
5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thủy sản đã được xác định không có các kháng sinh thuộc nhóm tetracycline. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1.
5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
Thêm 100 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 mg/ml (3.9) vào 5,00 g mẫu trắng. Đồng nhất mẫu bằng máy nghiền (4.10). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo 5.1.
5.4 Làm sạch dịch chiết
5.4.1 Chuẩn bị cột
Nối cột Sep-Pak C18 (4.12) vào đầu ra của một xơranh thủy tinh dung tích 100 ml (4.5). Thêm lần lượt 20 ml metanol (3.1), 20 ml nước vào xơranh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột.
5.4.2 Làm sạch dịch chiết
5.4.2.1 Cho lần lượt các dịch chiết trong ống ly tâm thu được theo 5.1.4, 5.2 và 5.3 vào các cột Sep-Pak đã được chuẩn bị theo 5.4.1. Tráng rửa bình chứa bằng 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA (3.5). Trong giai đoạn này, các kháng sinh nhóm tetracycline sẽ được hấp phụ lên bề mặt các hạt rắn chứa trong cột.
Chú ý không được để cho cột Sep-Pak khô ở giữa hai giai đoạn chuẩn bị cột và làm sạch dịch chiết. Điều chỉnh cho dịch chảy ra khỏi cột từng giọt.
5.4.2.2 Cho 20 ml nước vào xơranh thủy tinh và cho chảy qua cột. Loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. Làm khô cột bằng dòng không khí sạch trong 2 min.
5.4.2.3 Giải hấp các kháng sinh nhóm tetracycline bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axit oxalic-metanol (3.3) chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/min. Thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức 10 ml. Định mức tới vạch (thể tích V) bằng nước. Tiến hành phân tích dịch thu được trên HPLC theo 5.5.
5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC
5.5.1 Điều kiện phân tích
– cột sắc ký: cột pha đảo C8 (4.13);
– nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng;
– pha động: hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitril (3.6);
– tốc độ dòng: 1,2 ml/min;
– bước sóng cài đặt cho detector UV: 350 nm;
– thể tích tiêm: 60 ml.
5.5.2 Ổn định cột sắc ký trong 30 min bằng pha động (3.6).
5.5.3 Tiêm các dung dịch kháng sinh chuẩn (3.10) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính chiều cao pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ (mg/ml) từng loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính (y = ax + b).
Đường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995.
5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC theo qui định tại 5.5.3 . Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
CHÚ THÍCH: Sau khi phân tích xong, làm sạch hệ thống HPLC (bao gồm cả cột sắc ký) bằng hỗn hợp: nước - metanol (3.1) - axetonitril (3.2) theo tỷ lệ 7:1:2 (thể tích) trong 30 min.
5.5.5 Đối với các mẫu chứa ít hơn 0,5 mg/g kháng sinh nhóm tetracycline, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu và dung dịch kháng sinh chuẩn trên cột C18 (4.14) chạy cùng chế độ như cột C8 (4.13) và so sánh thời gian lưu của pic mẫu và pic chuẩn.
Hàm lượng của từng kháng sinh nhóm tetracycline có trong mẫu thử, C, biểu thị bằng microgam trên kilogam (mg/kg) được tính theo công thức sau:
trong đó
Y là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết và chiều cao pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài;
a, b là các hệ số của đường chuẩn y = ax + b;
V là thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (xem 5.4.2.3), tính bằng mililit (ml)
m là khối lượng mẫu đã sử dụng (xem 5.1.1), tính bằng gam (g).
7.1 Độ lặp lại
Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS, tính theo chiều cao pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch kháng sinh chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
7.2 Độ thu hồi
Độ thu hồi, R, được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn hơn 80 %.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] AOAC 995.09 Chlortetracycline, Oxytetracycline and Tetracycline in Edible Animal Tissues. Liquid Chromatographic Method