TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
Fish and fishery products - Determination of organophosphorus pesticides residues - Method using gas chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8347 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng của các loại thuốc bảo vệ thực vật phospho hữu cơ (OP), trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng hệ thống sắc ký khí (GC).
Phương pháp này có thể áp dụng để xác định các hợp chất: dimethoate, chlorfenvinphos, chlorpyrifos, methidathion và phosmet
Giới hạn phát hiện của phương pháp: từ 0,2 mg/kg đến 1 mg/kg.
Thuốc bảo vệ thực vật OP trong mẫu thủy sản được chiết tách ra bằng hỗn hợp axetonitril-axeton. Dịch chiết được làm sạch trên cột silicagel, sau đó được chiết tách làm 2 phân đoạn. Hàm lượng các thuốc bảo vệ thực vật OP trong các phân đoạn chiết được xác định trên hệ thống GC với 2 detector: detector bắt giữ electron (ECD) và detector ion hoá nhiệt phát hiện nitơ-phospho (NPD).
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.
3.1 Natri sulfat, dạng hạt, được làm khô bằng cách sấy qua đêm ở nhiệt độ 350 0C và giữ trong chai thuỷ tinh.
3.2 Hexan, loại dùng cho GC.
3.3 Etyl axetat, loại dùng cho HPLC.
3.4 Khí mang heli, loại dùng cho GC.
3.5 Bông thuỷ tinh, SUPELCO, 2-0411 hoặc loại tương đương.
3.6 Silicagel, cỡ hạt 60 mesh (silica-60), Merck, Darmstadt, Đức hoặc loại tương đương.
3.7 Silicagel đã hoạt hoá
Cân một lượng silicagel (3.6), rửa sạch bằng diclometan rồi cho vào trong chén sứ và để trong tủ sấy ở nhiệt độ 120 0C trong vòng 12 h. Sau đó, dùng giấy thiếc bọc kín miệng chén sứ rồi để lại vào tủ sấy ở nhiệt độ 120 0C trước khi sử dụng.
3.8 Xelit.
3.9 Dung dịch rửa giải
Hỗn hợp gồm dung dịch axetonitril (loại dùng cho GC) và axeton (loại dùng cho GC) theo tỷ lệ thể tích 9:1 được pha trước khi sử dụng.
3.10 Các chất chuẩn thuốc bảo vệ thực vật OP (Promochem, Wesel, Đức hoặc loại tương đương): dimethoate, chlorfenvinphos (đồng phân E+Z), chlorpyrifos, methidathion và phosmet, độ tinh khiết lớn hơn 99 %.
3.11 Dung dịch chuẩn thuốc bảo vệ thực vật OP trong axeton
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn thuốc bảo vệ thực vật OP trong axeton từ các chất chuẩn (3.10). Tuỳ theo nồng độ thuốc bảo vệ thực vật có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng axeton (loại dùng cho GC) thích hợp.
CHÚ THÍCH: Các chuẩn phải được bảo quản ở nhiệt độ – 20 0C.
3.12 Dung dịch chuẩn thu hồi
Pha các chuẩn của các OP trong axeton để có hàm lượng trong khoảng 0,005 mg/ml đến 50 mg/ml.
3.13 Dung dịch chuẩn trung gian
Pha loãng các chuẩn ban đầu (3.11) trong axeton được các dung dịch chuẩn trung gian.
3.14 Dung dịch chuẩn làm việc
Pha loãng các chuẩn trung gian (3.13) trong hexan (3.2) được các chuẩn làm việc. Các chuẩn làm việc được dùng để bơm vào GC.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Cốc thủy tinh có mỏ.
4.5 Máy nghiền.
4.6 Máy trộn cao tốc.
4.7 Máy cô quay chân không.
4.8 Tủ sấy.
4.9 Lò nung.
4.10 Máy sắc ký khí, được trang bị detector ECD và NPD.
4.11 Cột sắc ký thủy tinh, có van khoá, chiều dài 150 mm, đường kính trong 5 mm và chiều dài 50 mm, đường kính trong 20 mm.
4.12 Cột mao quản (cho máy GC), loại HP Ultra 2, chất nhồi cột chứa 5 % metylsilicol, chiều dài 25 m, đường kính trong 0,2 mm, độ dày lớp pha tĩnh 0,33 mm hoặc tương đương.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Cân 5 g mẫu đã được nghiền bằng máy nghiền (4.5), chính xác đến 0,1 mg, rồi cho vào cốc thuỷ tinh có mỏ (4.2). Thêm 1 g xelit (3.8), 30 g natri sulfat khan (3.1) rồi nghiền đều. Tiếp tục thêm vào 150 ml dung dịch rửa giải (3.9) rồi trộn hỗn hợp trong 3 min trong máy trộn cao tốc (4.6) để chiết lấy các thuốc bảo vệ thực vật từ mẫu. Sau đó, lọc dung dịch bằng giấy lọc.
5.1.2 Sản phẩm chiết được cô đặc trên máy cô quay đến khoảng 5 ml, sau đó cô tiếp cho đến khô trên máy cô quay (4.7) trong chế độ chân không ở nhiệt độ 40 0C. Hoà cặn thu được 1 ml hexan (3.2) rồi làm sạch dịch chiết theo 5.4.
5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có chứa thuốc bảo vệ thực vật gốc OP. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử theo quy định tại 5.1.
5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
Thêm 1 ml dung dịch chuẩn thu hồi (3.12) có hàm lượng từ 0,005 mg/ml đến 50 mg/ml vào 5 g mẫu trắng, trộn đều mẫu bằng máy nghiền (4.5). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử theo quy định tại 5.1.
5.4 Làm sạch dịch chiết
5.4.1 Chuẩn bị cột
Chuẩn bị cột, gồm bông thuỷ tinh (3.5), 1,3 g silicagel đã hoạt hoá (3.7), 1 g natri sulfat khan (3.1). Trước khi tiến hành phân tích, cho vào cột 5 ml etyl axetat (3.3) và sau đó là 5 ml hexan (3.2).
5.4.2 Làm sạch dịch chiết
5.4.2.1 Chuyển dịch thu được theo 5.1.2, 5.2 và 5.3 vào các cột sắc ký đã được chuẩn bị (5.4.1).
5.3.3 Rửa dung dịch trong cột với 5 ml hexan (3.2), sau đó với 2 ml hỗn hợp hexan-etyl axetat theo tỷ lệ thể tích 95:5. Tiếp theo, rửa giải với 8 ml hỗn hợp hexan-etyl axetat theo tỷ lệ thể tích 50:50 rồi tách lấy phân đoạn 1. Sau đó, tiếp tục rửa giải với 5 ml etyl axetat rồi tách lấy phân đoạn 2. Tốc độ rửa giải phải luôn điều chỉnh đạt 10 giọt/min.
5.3.1 Thu các phân đoạn chiết vào các bình thuỷ tinh đáy tròn của máy cô quay chân không (4.7). Tiến hành cô trên máy cô quay cho đến khô. Sau đó, thêm chính xác 1 ml hexan vào từng bình, lắc cho tan đều rồi hút để bơm vào máy GC theo 5.5.
5.5 Tiến hành phân tích trên GC
5.5.1 Điều kiện phân tích
a) Máy sắc ký khí sử dụng detector ECD và NPD, chọn chế độ bơm tự động, mỗi lần một lượng 2 ml theo chế độ tiêm không chia;
b) Chế độ nhiệt của hệ thống GC:
- nhiệt độ của buồng tiêm: 270 0C;
- nhiệt độ detector ECD: 300 0C, tốc độ dòng N2: 60 ml/min;
- nhiệt độ detector NPD: 270 0C, tốc độ dòng He: 30 ml/min, tốc độ dòng H2: 3 ml/min, tốc độ dòng không khí: 100 ml/min;
- chương trình nhiệt độ cột (mô tả chi tiết trong Hình 1): duy trì ở 90 0C trong 1 min; tăng 30 0C/min, lên tới 180 0C; tăng 4 0C/min, lên tới 270 0C và duy trì ở 270 0C trong 20 min;
c) Cột sắc ký: cột mao quản (4.12);
d) Khí mang: heli, tốc độ 0,5 ml/min.
Hình 1 – Chương trình nhiệt độ cột của hệ thống GC
5.5.2 Dựng đường chuẩn
Tiêm các dung dịch chuẩn làm việc (3.14) vào máy GC theo thứ tự từ nồng độ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại thuốc bảo vệ thực vật theo quan hệ tuyến tính.
Đường chuẩn của mỗi cấu tử phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.
5.5.3 Tiến hành phân tích
Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi đã được làm sạch (5.3.1) vào hệ thống GC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
Hàm lượng từng loại thuốc bảo vệ thực vật có trong mẫu, C, được biểu thị bằng microgam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau:
trong đó
Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào GC, tính theo đơn vị diện tích;
a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo 5.5.2;
V là thể tích phân đoạn dịch chiết thu được sau khi làm sạch (xem 5.4.2.3), tính bằng mililit (ml)
M là khối lượng mẫu thủ (xem 5.1.1), tính bằng gam (g).
7.1 Độ lặp lại
Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS, tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
7.2 Độ thu hồi
Độ thu hồi, R, được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã được bổ sung một lượng dung dịch chuẩn để tính đuợc hàm lượng chính xác. Độ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 70 % đến 110 % (tuỳ theo hàm lượng OP có trong mẫu).
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] F. Hernandez, R. Serrano, J, Beitran, F. J. Lopez, Comparison of Cleanup Techniques for Simple Method for Analysis of Selected Organophosphorus Pesticide Residues in Molluscs, J.AOAC, Vol. 79(1996): 124-131