THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( PHÁT HIỆN SALMONELLA
BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERAZA (PCR)
Fish and fishery products - Detection of Salmonella using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique
Lời nói đầu
TCVN 8342 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thônđề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi (PCR).
Phương pháp này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích (một đoạn trong gen invA) có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agaroza, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn cực tím (UV) ở bước sóng 302 nm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.
CHÚ THÍCH: Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI-1 (Salmonella pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S. bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I. InvA là một bản gen luôn có mặt trong hệ thống gen inv.
3. Thuốc thử, môi trường và vật liệu
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước được sử dụng là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.
3.1Cặp mồi
Gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của hai mồi như sau:
invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3';
invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3'.
Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE. Đệm TE có thành phần như sau: 10 mM Tris-HCl (pH = 8) và 1 mM EDTA.
3.2Môi trường nuôi cấy
Khuyến khích sử dụng môi trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây.
Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong trường hợp sử dụng các vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành phần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh và sinh học phân tử.
3.2.1Dung dịch đệm pepton
3.2.1.1 Thµnh phÇn
Pepton (C5H10O5) | 10,0 g |
Natri clorua (NaCl) | 5,0 g |
Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) | 3,6 g |
Kali dihydro phosphat (KH2PO4) | 1,5 g |
Nước | 1 000 ml |
3.2.1.2 ChuÈn bÞ
Hoà tan các thành phần trong nước, đun tan, phân phối vào trong các bình chứa phù hợp. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 min, pH sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 0C.
3.2.2Hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR 1,1x
3.2.2.1 Thµnh phÇn
Taq polymeraza | 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml) |
Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25 0C) | 75 mM |
Amoni sulfat [(NH4)2SO4] | 20 nM |
Tween 20 | 0,01 % (thể tích) |
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 200 mM (mỗi loại) |
Magiê clorua (MgCl2) | 1,5 mM |
3.2.2.2 ChuÈn bÞ
Tất cả các thành phần trên được pha chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt độ 4 0C trong 1 tháng. Có thể bảo quản ở nhiệt độ – 20 0C trong 1 năm. Không nên rã đông và tái đông dung dịch đã pha chế nhiều lần.
3.3Thang ADN
Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo trong phương pháp này.
3.4 Agaroza
Agaroza sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ hơn 1 000 bp.
3.5 Đệm điện di TAE 1x
3.5.1 Thµnh phÇn
Tris | 4,84 g |
Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0 | 2 ml |
Axit axetic băng | 1,14 ml |
Nước vừa đủ | 1 000 ml |
3.5.2 ChuÈn bÞ
Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha loãng với nước thành dung dịch 1x.
3.6 Đệm tải mẫu 6x
3.6.1 Thµnh phÇn
Glyxerol | 30 % |
Xanh bromphenon | 0,25 % |
Tris | 200 mM |
Na2EDTA | 20 mM |
3.6.2 ChuÈn bÞ
Các thành phần trên được pha trong nước, bảo quản ở nhiệt độ 4 0C.
3.7 Thuốc nhuộm AND, dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml.
CẢNH BÁO – Thuốc nhuộm etyl bromua là một chất độc có thể gây ung thư cho người và động vật. Do đó, khi sử dụng hoá chất này phải có găng tay và kính bảo hộ. Dung dịch sau khi sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ.
Sö dông c¸c thiÕt bÞ, dông cô cña phßng thö nghiÖm vi sinh th«ng thêng vµ cô thÓ nh sau:
4.1Tủ ấm, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 0C.
4.2Máy luân nhiệt.
4.3Máy ly tâm, loại dùng cho ống eppendorf 1,5 ml.
4.4Máy lắc ống nghiệm.
4.5Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di, có điện thế hoạt động từ 80 V đến 150 V.
4.6Hộp đèn soi UV, có kính lọc 302 mm.
CẢNH BÁO – Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ.
4.7Bộ chụp ảnh trên đèn UV.
4.8Ống Eppendorf, 0,2; 0,5 và 1,5 ml, loại chuyên dùng cho PCR.
5. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử
Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
Việc lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thoả thuận về vấn đề này.
6.1 Phần mẫu thử
Cân chính xác 25 g mẫu thử (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào bình nón hoặc bao PE vô trùng.
6.2 Tăng sinh
Giai đoạn tăng sinh được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm.
Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0 0C ± 1,0 0C trong khoảng 18 h ± 2 h.
6.3 Xử lý mẫu giải phóng ADN
Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN. Cách xử lý như sau:
a) Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 r/min trong 5 min rồi loại bỏ phần nước. Rửa sinh khối với nước rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước.
b)Pha loãng huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước. Đun sôi cách thuỷ trong 10 min. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 r/min trong 5 min để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại.
6.4 Khuếch đại
Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.
CẢNH BÁO
– Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu.
– Phòng thử nghiệm phải được bố trí tách khỏi khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.
6.4.1 Chuẩn bị ống khuếch đại
Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR dung tích 0,2 ml hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng dung tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.
Đối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết.
Đối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước.
6.4.2 Chương trình khuếch đại
Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau:
Duy trì nhiệt độ 95 0C trong 5 min để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95 0C/60 s; 54 0C/45 s và 72 0C/60 s. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72 0C trong 10 min, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20 0C cho đến khi điện di.
6.5 Điện di sản phẩm khuếch đại
6.5.1 Chuẩn bị gel điện di agaroza 1 %
Gel agaroza 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 mm đến 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.
6.5.2 Chuẩn bị dịch điện di
Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều.
6.5.3 Điện di
Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agaroza. Tiến hành điện di trong 60 min ở hiệu điện thế 100 V.
6.6 Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại
6.6.1 Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu
Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 l nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di.
6.6.2 Nhuộm gel
Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 min. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 min đến 5 min để loại bỏ phần etyl bromua dư.
6.6.3 Quan sát, chụp hình
Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả.
Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích thước 520 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này.
Mẫu được kết luận là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] CHENG HSUN CHIU and JONATHAN T.OU., Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence gens, invA and spvC, by an Enrichment broth culture multiplex PCR combination assay, Journal of Clinical microbiology, p.2619-2622. Oct. 1996.
[2] JS. WAY, KL. JOSEPHSON, SD. PILLAI, M. ABBASZADAGAN, CP. GERBA and IL. PEPPER., Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction, Appl. Environ. Microbiol., 59 (5) : 1473 - 1479, 1993.
[3] CAROLA BURTSCHER, PAPA A. FALL, PETER A. WILDERER, and STEFAN WUERTZ., Detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in Suspended Organic Waste by Nucleic Acid Extraction and PCR, Appl. Environ. Microbiol., 65 (5): 2235 - 2237, 1999.
[4] Nordic commitees on food analysis (NMKL) No 71, 5th ed., 1999, Salmonella. Detection in foods.