TCVN 8341:2010
NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY (DSP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Bivalve molluscs - Determination of diarrhetic shellfish poisons (DSP) content - Method using high-performance liquid chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8341 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
TCVN 8341:2010
NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY (DSP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Bivalve molluscs - Determination of diarrhetic shellfish poisons (DSP) content - Method using high-performance liquid chromatography
1. Phạm vi áp dụng
2. Nguyên tắc
Độc tố DSP trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở các dạng dẫn xuất axit okadeic (OA), dinophysistoxin-1 (DTX-1) và dinophysistoxin-2 (DTX-2) chứa nhóm chức cacboxyl, được chuyển sang dạng huỳnh quang bằng phản ứng este hoá với 9-anthryl-diazometan (ADAM) và được định lượng bằng hệ thống HPLC dùng detector huỳnh quang.
3. Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Metanol, loại dùng cho HPLC.
3.2 n-hexan, loại dùng cho HPLC.
3.3 Cloroform.
3.4 Khí nitơ.
3.5 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
3.6 Dung dịch cloroform chứa 1,15 % etanol
Cho 50 g alumin (đã hoạt hoá ở nhiệt độ 450 oC qua đêm) vào trong một cột thuỷ tinh khô (đường kính trong 35 cm, dài 21 mm) có khoá chặn bằng nhựa teflon. Rót cloroform (3.3) qua cột rồi loại bỏ 10 ml cloroform ban đầu qua cột. Hứng lấy 50 ml cloroform tiếp theo vào trong bình định mức dung tích 50 ml (4.7) có chứa sẵn 575 ml etanol khan.
3.7 Dung dịch AcOA
Hoà tan 100 mg axit 7-O-axetyl okadaic (AcOA) chuẩn trong 1 ml metanol (3.1).
3.8 Dung dịch DCA
Hoà tan 3,5 mg axit deoxycolic (DCA) chuẩn (độ tinh khiết 98 %) trong 100 ml metanol (3.1).
3.9 Dung dịch OA
Pha chính xác dung dịch chất chuẩn axit okadaic (OA) trong metanol (3.1) thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 1,0; 2,5; 5,0 và 12,5 mg/ml.
3.10 Dung dịch DSP chuẩn
Cho chính xác 400 ml của một trong các loại nồng độ dung dịch OA (3.9) với 140 ml dung dịch DCA (3.8), 50 ml dung dịch AcOA (4.321) và 110 ml metanol (3.1) vào một lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9). Nếu không có dung dịch AcOA, có thể thay bằng 50 ml metanol (3.1).
3.11 Dung dịch ADAM
Hoà tan 2 mg 9-anthryl-diazometan (ADAM) trong 1 ml metanol (3.1) dưới ánh sáng vàng và bảo quản trong tối ở nhiệt độ –80 0C. Dung dịch ADAM đã chuẩn bị được sử dụng trong thời gian 24 h.
CHÚ THÍCH: ADAM được chứa trong lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9), mỗi lọ chứa 2 mg ADAM, được bảo quản ở nhiệt độ –80 0C.
3.12 Mẫu thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ chuẩn, đã biết hàm lượng DSP.
4. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Rây, cỡ số 5.
4.3 Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min.
4.4 Ống li tâm, dung tích 15 ml và 50 ml.
4.5 Máy siêu âm.
4.6 Cột tách chiết lỏng rắn (SPE), dung tích 7 ml, chứa hạt silicagel đường kính 40 mm, đã sấy ở nhiệt độ 130 0C không ít hơn 24 h.
4.7 Bình định mức, dung tích 50 ml.
4.8 Máy ly tâm, tốc độ 5 000 r/min.
4.9 Lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu, dung tích 1,5 ml, có nút xoáy và vòng đệm bằng nhựa teflon, đã được rửa kỹ bằng axeton và sấy khô qua đêm trong tủ sấy ở nhiệt độ 70 0C.
4.10 Ống nghiệm, dung tích 50 ml.
4.11 Hệ thống HPLC, với detector huỳnh quang.
4.12 Cột sắc ký, có đường kính trong 4,6 mm, dài 25 cm, có chứa hạt RP-18 octadecylsilica đường kính 5 mm.
4.13 Micropipet, có thang đo từ 10 ml đến 1 000 ml.
5. Cách tiến hành
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Rửa sạch vỏ của nhuyễn thể trước khi mở để lấy thịt. Rửa nhanh thịt nhuyễn thể trong nước để loại bỏ cát sạn và các tạp chất khác. Tránh làm dập nát thịt nhuyễn thể.
5.1.2 Cân một lượng thịt nhuyễn thể, w1, chính xác đến 0,1 mg, sao cho có được khối lượng phần nội tạng khoảng 20 g. Tách phần nội tạng của nhuyễn thể ra cho lên rây cỡ số 5 (4.2) rồi để yên trong 5 min để loại bỏ hết nước. Cân lượng nội tạng này, w2, chính xác đến 0,1 mg. Sau đó, mẫu được nghiền trong máy nghiền (4.3) cho đến khi đồng nhất.
5.2 Tách chiết độc tố từ mẫu thử
5.2.1 Cân khoảng 2,0 g nội tạng nhuyễn thể đã được đồng nhất theo 5.1.2, w3, chính xác đến 0,1 g cho vào một ống ly tâm dung tích 50 ml (4.4). Thêm chính xác vào ống 114 ml dung dịch AcOA (3.7) và 7,886 ml hỗn hợp dung dịch metanol (3.1) và nước theo tỷ lệ thể tích 80:20. Nếu không có dung dịch AcOA thì cho vào ống ly tâm lượng chính xác 8,0 ml hỗn hợp dung dịch metanol (3.1) và nước theo tỷ lệ thể tích 80: 20.
5.2.2 Đồng nhất hỗn hợp trong ống bằng máy nghiền (4.3) với tốc độ từ 6 000 r/min đến 10 000 r/min trong 3 min. Sau đó, đặt ống ly tâm vào bể nước của máy siêu âm (4.5) khoảng 10 min. Ly tâm hỗn hợp trong máy ly tâm (4.8) với tốc độ 5 000 r/min trong 10 min rồi gạn phần dung dịch trong ống sang một lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9).
5.3.1 Cho chính xác 5,0 ml dung dịch đã chuẩn bị theo 5.2.2 vào một ống ly tâm dung tích 15 ml (4.4). Tiến hành chiết 2 lần với n-hexan (3.2), mỗi lần cho vào 5 ml và lắc mạnh trong khoảng 30 s, sau đó loại bỏ lớp n-hexan.
5.3.2 Thêm 1 ml nước và 6 ml cloroform (3.3) vào ống ly tâm. Lắc mạnh ống trong khoảng 30 s để trộn đều. Chuyển lớp cloroform ở phía dưới vào một ống nghiệm dung tích 50 ml (4.10).
5.3.3 Lớp dung dịch còn lại trong ống ly tâm được tách chiết lần nữa với 6 ml cloroform (3.3) rồi tiếp tục chuyển lớp cloroform này vào ống nghiệm nói trên.
5.3.4 Làm bay hơi dung dịch trong ống nghiệm có cloroform (3.3) đến khô bằng dòng khí nitơ (3.4). Hoà tan cặn còn lại bằng cách cho 200 ml dung dịch DCA (3.8) và 800 ml metanol (3.1) vào trong ống rồi lắc đều. Chuyển dung dịch trong ống nghiệm vào một lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9).
5.4 Tạo dẫn xuất huỳnh quang với ADAM
5.4.1 Chuẩn bị 3 lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9). Sau đó, cho 35,0 ml dung dịch đã chuẩn bị theo 5.3.4 vào lọ thứ nhất (mẫu thử), 35,0 ml dung dịch DSP chuẩn (3.10) vào lọ thứ hai (mẫu chuẩn) và 35,0 ml metanol (3.1) vào lọ thứ ba (mẫu trắng). Cho thêm vào mỗi lọ 100 ml dung dịch ADAM (3.11) (chú ý: phải sử dụng ánh sáng vàng trong giai đoạn này để tránh ADAM bị phân hủy). Đậy chặt các lọ và để trong bể nước của máy siêu âm (4.5) ở nhiệt độ khoảng 37 0C trong 10 min. Sau đó, tiếp tục lưu giữ các lọ ở nhiệt độ 37 0C trong tối với thời gian 2 h.
5.4.2 Làm khô dung môi trong các lọ thuỷ tinh bằng dòng khí nitơ (3.4) hay máy ly tâm chân không. Hoà tan cặn trong các lọ bằng 300 ml hỗn hợp dung dịch cloroform (3.3) và n-hexan (3.2) theo tỷ lệ thể tích 1:1.
5.5 Tinh chế dẫn xuất bằng cột SPE
5.5.1 Hoạt hoá cột SPE
Cho lần lượt 6 ml cloroform (3.3) và 3 ml hỗn hợp dung dịch cloroform (3.3) và n-hexan (3.2) theo tỷ lệ thể tích 1:1 đi qua cột SPE (4.6). Không được để cột khô trong quá trình hoạt hoá. Sau khi hoạt hoá, phải giữ mức dung môi trong cột cao hơn mặt gel của cột nhồi.
5.5.2 Tinh chế dẫn xuất ADAM
5.5.2.1 Cho dung dịch dẫn xuất ADAM đã chuẩn bị theo 5.4.2 qua cột SPE (4.6) đã chuẩn bị theo 5.5.1 với tốc độ 1 giọt/s. Loại bỏ dung dịch đi qua cột.
5.5.2.2 Rửa cột lần lượt bằng 5 ml hỗn hợp dung dịch cloroform (3.3) và n-hexan (3.2) theo tỷ lệ thể tích 1:1 và 5 ml dung dịch cloroform chứa 1,15 % etanol (3.6). Loại bỏ dung dịch rửa đi qua cột.
5.5.3 Thu hồi dẫn xuất ADAM
Cho 5 ml hỗn hợp dung dịch metanol (3.1) và cloroform (3.3) theo tỷ lệ thể tích 1:9 qua cột SPE (4.6) rồi hứng lấy dung dịch đi qua cột. Làm khô dung dịch thu được bằng dòng khí nitơ (3.4). Hoà tan cặn trong 500 ml metanol (3.1) và đem phân tích trên HPLC (4.11).
5.6 Phân tích độc tố trên HPLC
5.6.1 Điều kiện phân tích
- cột sắc ký HPLC (4.12);
- pha động: hỗn hợp dung dịch axetonitril (3.5) và nước theo tỷ lệ thể tích 8:2;
- chế độ đẳng nhiệt ở 40 0C;
- tốc độ dòng 1,0 ml/min;
- thể tích mỗi lần bơm là 10 ml;
- bước sóng cài đặt cho detector huỳnh quang: bước sóng kích thích 254 nm và bước sóng phát xạ 410 nm.
5.6.2 Dựng đường chuẩn
Bơm các dẫn xuất ADAM của các dung dịch DSP chuẩn (3.10) đã chuẩn bị theo 5.5 vào HPLC và dựng đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ nhận được theo diện tích pic. Khi đường chuẩn tuyến tính và đi qua gốc tọa độ thì trong các lần phân tích sau này, chỉ sử dụng 1 dung dịch DSP chuẩn (3.10) có hàm lượng DSP gần với hàm lượng có trong mẫu thử. Đường chuẩn lúc này được xây dựng từ độ hấp thụ của dung dịch sử dụng và gốc toạ độ.
5.6.3 Xác định độc tố DSP
Bơm dẫn xuất ADAM của mẫu thử (xem 5.4) và dẫn xuất ADAM của mẫu trắng (xem 5.5) vào HPLC. Mỗi mẫu được bơm 2 lần. Tính độ hấp thụ trung bình cho mỗi mẫu theo diện tích pic sau khi đã trừ đi độ hấp thụ của mẫu trắng.
Bơm các dung dịch DSP chuẩn (3.10) vào HPLC với tần suất 2 h bơm 1 lần.
6. Tính kết quả
Hàm lượng độc tố DSP (OA hoặc DTX-1 hoặc DTX-2) trong mẫu thử thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ, CDSP, được tính bằng miligam trên gam (mg/g) theo công thức sau:
- trong trường hợp có sử dụng AcOA:
- trong trường hợp không sử dụng AcOA:
trong đó
AS là độ hấp thụ trung bình của độc tố có trong mẫu thử, tính theo diện tích pic;
AC là độ hấp thụ trung bình của độc tố có trong dung dịch DSP chuẩn (3.10) nồng độ là CC, tính theo diện tích pic;
AIS là độ hấp thụ trung bình của AcOA có trong dung dịch mẫu thử, tính theo diện tích pic;
AIC là độ hấp thụ trung bình của AcOA có trong dung dịch DSP chuẩn (3.10), tính theo diện tích pic;
CC là nồng độ của độc tố cần xác định trong dung dịch DSP chuẩn (3.10), tính bằng miligam trên mililit (mg/ml).
w1 là khối lượng mẫu thử thịt nhuyễn thể, tính bằng gam (g);
w2 là khối lượng phần nội tạng thu được từ w1 (g) thịt nhuyễn thể, tính bằng gam (g);
w3 là khối lượng phần nội tạng của nhuyễn thể lấy để phân tích, tính bằng gam (g);
V là thể tích dịch chiết thu được (xem 5.3.4) tương ứng với khối lượng phần nội tạng của nhuyễn thể lấy để phân tích (xem 5.2.1), tính bằng milinit (ml) (V=2 ml tương ứng với w3=2,0 g)
7. Độ lặp lại và độ thu hồi
7.1 Độ lặp lại
Độ lệch chuẩn lặp lại, CVs, tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơm liên tiếp của cùng một dung dịch DSP chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
7.2 Độ thu hồi
Độ thu hồi, R, được xác định bằng cách đo 5 mẫu chuẩn đã biết chính xác hàm lượng độc tố DSP (3.12). Độ thu hồi thu được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.
8. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Intergovernmental Oceanographic Commission, IOC Manuals & Guides No. 33, 1995, Manual on Harmful Marine Microalga, p.95-112