TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 8340:2010
NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ (ASP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (PHẦN 1)
Bivalve molluscs - Determination of amnestic shellfish poisons (ASP) content - Method using high-performance liquid chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8340 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thônđề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
TCVN 8340:2010
NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ (ASP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (PHẦN 1)
Bivalve molluscs - Determination of amnestic shellfish poisons (ASP) content - Method using high-performance liquid chromatography
1. Phạm vi áp dụng
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,2 mg/g.
2. Nguyên tắc
Độc tố ASP (axit domoic) được chiết từ thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng dung dịch axit clohydric 0,1 M. Xác định hàm lượng axit domoic bằng HPLC dùng detector UV ở bước sóng 242 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
3. Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
3.2 Metanol, loại dùng cho HPLC.
3.3 Axit clohydric (HCl), nồng độ 0,1 M và 5 M.
3.4 Dung dịch natri hydroxit (NaOH), nồng độ 0,1 M.
3.5 Dung môi chiết
Pha hỗn hợp metanol (3.2) và nước theo tỷ lệ thể tích 1:1.
3.6 Pha động của HPLC
Pha 100 ml axetonitril (3.1) với khoảng 400 ml nước trong bình định mức dung tích 1 000 ml (4.2). Sau đó, thêm 1,0 ml dung dịch axit trifloaxetic (TFA) (loại dùng để đo quang) và định mức bằng nước đến vạch. Loại bỏ khí hoà tan trong pha động bằng cách để trong máy siêu âm (4.8) trong khoảng 10 min.
3.7 Dung dịch đệm xitrat, nồng độ 0,5 M, pH 3,2
Hoà tan 40,4 g axit xitric ngậm 1 phân tử nước và 14,0 g triamoni xitric với 400 ml nước trong bình định mức dung tích 500 ml (4.2). Sau đó, thêm 50 ml axetonitril (3.1) và định mức bằng nước đến vạch.
3.8Dung dịch axit domoic chuẩn
Pha chính xác axit domoic chuẩn (độ tinh khiết 98 %) thành các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,1 mg/ml đến 10 mg/ml bằng hỗn hợp axetonitril (3.1) và nước theo tỷ lệ thể tích 1:10.
3.9 Mẫu thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ chuẩn, hàm lượng axit domoic 100 mg/g.
4. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.2 Bình định mức, dung tích 500 ml và 1 000 ml.
4.3 Cốc thuỷ tinh, dung tích 500 ml.
4.4 Ống đong, dung tích 2 ml và 250 ml.
4.5 Giấy đo pH hoặc dụng cụ đo pH
4.6 Rây, cỡ số 5.
4.7 Máy nghiền tốc độ cao, 10 000 r/min.
4.8 Máy siêu âm.
4.9 Máy ly tâm, tốc độ 5 000 r/min.
4.10 Màng lọc mao quản, cỡ lỗ 0,45 mm.
4.11 Cột trao đổi anion SAX, dung tích 3 ml, chứa khoảng 500 mg hạt silicagel đã được hoạt hoá với silan amoni bậc 4, LC-8.
4.12 Hệ thống HPLC, được trang bị detector UV.
4.13 Cột sắc ký loại RP C18, dài 25 cm, đường kính trong 4,6 mm, có chứa hạt silicagel đường kính từ 5 mm đến 10 mm.
5. Cách tiến hành
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Rửa sạch vỏ của nhuyễn thể trước khi mở để lấy thịt. Rửa nhanh thịt nhuyễn thể trong nước để loại bỏ cát sạn và các tạp chất khác. Cần tránh làm dập nát thịt nhuyễn thể.
5.1.2 Cân khoảng 150 g thịt nhuyễn thể và cho lên rây cỡ số 5 (4.6), để yên trong 5 min để loại bỏ hết nước. Sau đó, mẫu được nghiền trong máy nghiền tốc độ cao (4.7) cho đến khi đồng nhất.
5.2 Tách chiết độc tố ASP từ mẫu thử
5.2.1Phương pháp tách chiết độc tố ASP cùng với độc tố gây liệt cơ(PSP)
5.2.1.1 Cân khoảng 100,0 g mẫu thịt nhuyễn thể đã được đồng nhất (xem 5.1.2), chính xác đến 0,1 mg, cho vào một cốc dung tích 500 ml (4.3). Thêm 100 ml dung dịch axit clohydric nồng độ 0,1 M (3.3) rồi khuấy đều. Kiểm tra độ pH bằng giấy đo pH hoặc dụng cụ đo pH (4.5). Độ pH của hỗn hợp phải nhỏ hơn 4, tốt nhất là bằng 3. Điều chỉnh pH nếu cần thiết.
CHÚ THÍCH Điều chỉnh độ pH của hỗn hợp như sau:
-giảm độ pH bằng cách thêm từng giọt dung dịch axit clohydric 5 M (3.3) rồi khuấy đều.
-tăng độ pH bằng cách cho thêm từng giọt dung dịch natri hydroxit 0,1 M (3.4). Khi thêm natri hydroxit, phải khuấy mạnh và liên tục để tránh hiện tượng kiềm hoá cục bộ.
5.2.1.2 Đun sôi hỗn hợp thu được trong 5 min, sau đó để nguội đến nhiệt độ trong phòng. Kiểm tra lại độ pH của hỗn hợp và điều chỉnh độ pH đến khoảng từ 2 đến 4 (chú ý pH không được vượt quá 4,5).
5.2.1.3 Chuyển hỗn hợp sang ống đong dung tích 250 ml (4.4) rồi thêm nước tới vạch 200 ml. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 3 000 r/min trong thời gian 10 min. Lọc lớp nước trong phía trên qua màng lọc (4.10). Dịch lọc thu được dùng để phân tích trên thiết bị HPLC (4.12).
Quá trình chiết độc tố và phân tích trên hệ thống HPLC phải được thực hiện trong vòng 24 h.
CHÚ THÍCH: Phương pháp này đơn giản nhưng độ chính xác không cao, vì axit domoic đã bị phân hủy một phần trong môi trường axit. Chỉ được sử dụng phương pháp này trong trường hợp hàm lượng axit domoic trong mẫu nhỏ hơn hoặc bằng 5mg/g. Khi hàm lượng axit domoic lớn hơn 5 mg/g, phải kiểm chứng lại bằng phương pháp Quilliam (5.2.2).
5.2.2Phương pháp Quilliam (tách chiết bằng hỗn hợp metanol và nước)
5.2.2.1 Cân khoảng 4,0 g mẫu thịt nhuyễn thể đã được đồng nhất (xem 5.1.2) cho vào một ống ly tâm. Thêm 16,0 ml dung môi chiết (3.5).
5.2.2.2 Đồng nhất hỗn hợp bằng máy nghiền tốc độ cao (4.7) với tốc độ 10 000 r/min trong thời gian 3 min. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 3 000 r/min trong thời gian 10 min. Lọc lớp nước trong phía trên qua màng lọc (4.10) để thu được dịch lọc.
5.2.2.3 Tinh chế dung dịch chiết
a) Điều kiện hoạt hoá cột trao đổi ion
Cho lần lượt 6,0 ml metanol (3.2), 3,0 ml nước và 3,0 ml dung môi chiết (3.5) qua cột trao đổi ion (4.11). Sau khi điều kiện hoá cột, phải giữ mức dung môi trong cột cao hơn mặt trên của phần nhồi cột.
b) Tinh sạch dịch chiết
Cho 5,0 ml dung dịch chiết đã qua lọc (xem 5.2.2.2) chảy từ từ qua cột trao đổi ion đã được hoạt hoá (4.11) với tốc độ chảy khoảng 1 giọt/s. Loại bỏ dịch qua cột.
Cho 5,0 ml hỗn hợp axetonitril (3.1) và nước theo tỷ lệ thể tích 1:9 đi qua cột với tốc độ 1 giọt/s. Thêm 0,5 ml dung dịch đệm xitrat (3.7) khi mức dung dịch rửa xuống gần bề mặt gel của cột. Loại bỏ dịch qua cột.
c) Thu hồi độc tố
Cho 2 ml dung dịch đệm xitrat (3.7) đi qua cột và hứng dung dịch chảy qua cột trao đổi ion (4.11) bằng ống đong dung tích 2 ml (4.4) cho tới vạch định mức. Dung dịch chiết thu được dùng để phân tích trên thiết bị HPLC (4.2).
Chú ý không được để cột trao đổi ion bị khô trong quá trình tinh chế dung dịch chiết.
5.3 Phân tích độc tố ASP
5.3.1Điều kiện phân tích
-cột sắc ký HPLC (4.13);
-pha động chạy sắc ký (3.6);
-chế độ đẳng nhiệt ở 40 oC;
-tốc độ dòng trong khoảng từ 1,0 ml/min đến 1,5 ml/min;
-thể tích mỗi lần bơm là 20 ml;
-bước sóng cài đặt cho detector UV là 242 nm.
5.3.2Dựng đường chuẩn
Bơm các dung dịch axit domoic chuẩn nồng độ từ 0,1 mg/ml đến 10,0 mg/ml (3.8) vào thiết bị HPLC và dựng đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ thu được của các dung dịch axit domoic chuẩn. Khi đường chuẩn tuyến tính và đi qua gốc tọa độ thì khi xác định hàm lượng độc tố ASP trên mẫu thử, chỉ sử dụng một dung dịch axit domoic chuẩn có nồng độ gần với hàm lượng axit domoic tương đương có trong mẫu. Đường chuẩn lúc này được xây dựng từ độ hấp thụ của dung dịch axit domoic chuẩn sử dụng và gốc toạ độ.
5.3.3 Xác định độc tố ASP
Bơm các dịch chiết thu được (xem 5.2.1.3 hoặc 5.2.2.3) vào thiết bị HPLC. Mỗi dịch chiết được bơm 2 lần và xác định độ hấp thụ trung bình cho mỗi dịch chiết.
Bơm các dung dịch axit domoic chuẩn vào thiết bị HPLC với tần suất 2 h bơm 1 lần.
6. Tính kết quả
Hàm lượng độc tố ASP (tính theo axit domoic) trong mẫu thử thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ, CASP, được tính bằng microgam trên gam sản phẩm (mg/g) theo công thức sau:
trong đó:
AS là độ hấp thụ trung bình của dung dịch mẫu thử, tính theo diện tích pic;
AC là độ hấp thụ trung bình của dung dịch axit domoic chuẩn có nồng độ là Cc, tính theo diện tích pic;
CC là nồng độ của dung dịch axit domoic chuẩn, tính bằng miligam trên mililit (mg/ml);
m là khối lượng của mẫu thử, tính bằng gam (g);
F là hệ số pha loãng dịch chiết trước khi bơm vào thiết bị HPLC.
7. Độ lặp lại và độ thu hồi
7.1Độ lặp lại
Độ lệch chuẩn lặp lại, CVs, tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơm liên tiếp của cùng một dung dịch axit domoic chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
7.2 Độ thu hồi
Độ thu hồi, R, được xác định bằng cách đo 5 mẫu chuẩn đã biết chính xác hàm lượng độc tố ASP. Độ thu hồi thu được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.
8. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] AOAC 959.08 Paralytic Shellfish Poison. Biological Method.
[2] Intergovernmental Oceanographic Commission, IOC Manuals & Guides No. 33, 1995, Manual on Harmful Marine Microalga, p.113-134.