PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAPHEIN
Coffee
Determination of caffeine content
Xử lý cà phê bằng dung dịch amoniac để giải phóng caphein; làm sạch bằng dietyl ete tinh khiết trên 2 cột (cột thứ nhất môi trường kiềm, cột thứ hai môi trường axit). Chiết caphein bằng clorofoc tinh khiết và xác định hàm lượng của nó bằng phương pháp quang phổ.
- Cột sắc ký như hình vẽ;
- Máy quang phổ;
- ống đong thủy tinh dung tích 250 ml;
- Nồi cách thuỷ;
- Bình định mức dung tích 50 và 100ml;
- Pipet dung tích 2 và 5ml;
- Cân phân tích, độ chính xác ± 0,001g;
- Máy nghiền;
- Phễu thủy tinh đường kính 70mm;
- Cuvet thạch anh, chiều dầy lớp dung dịch 10mm;
- Axit sunfuric (H2SO4), dung dịch 2N, TKPT;
- Rây có đường kính lỗ 0,5mm;
- Natrihydroxit (NaOH), dung dịch 2N, TKPT;
- Diatomit đảm bảo hoàn nguyên ít nhất 98% cafein;
- Amoniac, dung dịch 5N, TKPT;
- Dietyl ete bão hoà nước, TKPT;
- Clorofoc bão hoà nước, TKPT;
- Giấy lọc tròn đường kính 120 mm;
- Caphein tinh thể, TKPT;
- Cát thạch anh, sạch, khô.
Theo TCVN 5702 - 1993.
4.1 Chuẩn bị mẫu
Lấy 50gam cà phê nhân từ mẫu trung bình, sấy sơ bộ ở nhiệt độ 80oC trong 2 giờ, nghiền trong máy nghiền đến khi bột nghiền lọt toàn bộ qua rây
Nếu cà phê đã rang thì không cần sấy sơ bộ mà đưa để nghiền ngay.
Mẫu sau khi nghiền, được bảo quản trong lọ thuỷ tinh mầu, nút mài, sạch và khô.
4.2 Xây dựng đường cong chuẩn
Cân 1 gam cà phê với sai số ± 0,001g hoà tan trong 50ml clorofoc đã được bão hoà bằng nước cất; chuyển vào bình định mức 100cm3, và cho clorofoc đến vạch. Hút lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ml dung dịch trên cho vào 12 bình định mức 100ml, và cho thêm clorofoc cho đến vạch. Lắc đều các bình một cách cẩn thận và lần lượt đo độ hấp phụ của các dung dịch trên bằng máy quang phổ ở bước sóng 276nm. Giá trị của độ hấp phụ tại một điểm trên đường cong chuẩn là mối quan hệ giữa độ hấp phụ của dung dịch và nồng độ caphein trong dung dịch ấy.
4.3 Chuẩn bị cột môi trường kiềm (hình vẽ) cột bằng thuỷ tinh hình trụ, có đường kính bên trong là 21mm, chiều dài 250mm. Đặt vào cột 1 miếng bông thủy tinh sạch (lớp 4).
Trộn cẩn thận 3 gam điatômit với 3ml dung dịch NaOH. Đưa bột nhão này vào trong cột và dùng đũa thủy tinh nhẹ nhàng nén cho lớp bột nhão chặt và đồng nhất (lớp 3).
4.4 Chuẩn bị cột có môi trường axit (hình 2), cột bằng thủy tinh, hình trụ, đường kính trong 17mm, dài 250mm.
Cho vào cột 1 miếng bông thuỷ tinh sạch (lớp 3). Cẩn thận trộn 3 gam điaômit với 3 ml dung dịch H2SO4. Cho bột nhão vào cột và dùng đũa thuỷ tinh nhẹ nhàng nén cho lớp bột nhão chặt và đồng nhất (lớp 2) trên lớp 2 đặt một miếng bông thuỷ tinh mỏng (lớp 1).
5.1 Độ ẩm của cà phê được xác định theo TCVN 5701 - 1993.
5.2 Cân 1 gam cà phê chuẩn bị ở mục 4.1 với sai số 0,001g cho vào bình 100cm3. Cho thêm 2g cát thạch anh đã nung và 5ml dung dịch amoniac trộn đều và để yên trong 3 phút. Đặt bình lên nồi cách thuỷ đang sôi trong 2 phút. Sau khi làm nguội, chuyển định lượng vào bình định mức 100ml và cho thêm nước cất cho đến vạch. Cẩn thận trộn đều dung dịch và để yên cho đến khi lắng cát hoàn toàn.
Dùng pipet hút lấy 5 ml dung dịch và cho vào cốc thuỷ tinh đã có chứa sẵn 6 gam điatômit, trộn đều một cách cẩn thận.
5.3 Chuyển vào cột kiềm lớp bột ẩm được chuẩn bị ở mục 5.2. Để tránh tổn thất caphein, cốc thuỷ tinh được làm sạch 2 lần bằng bột điatômit, mỗi lần 1 gam và cùng cho vào cột kiềm. Dùng đũa thuỷ tinh nhẹ nhàng nén để làm lớp bột ẩm đồng nhất và chặt (lớp 2) đặt một miếng bông thuỷ tinh lên trên (lớp 1).
5.4 Làm sạch và tách caphein.
Kẹp các cột lên giá sao cho chất lỏng từ cột kiềm, chẩy trực tiếp vào cột axit. Trên cột kiềm đặt 1 phễu nhỏ và từ từ rót 150 ml dietyl ete. Điều chỉnh van ở các cột sao cho luôn luôn tồn tại một lớp mỏng chất lỏng ở phía trên các chất chứa trong cột. Sau khi dietyl ete hoàn toàn chẩy hết, tháo bỏ cột kiềm và rót thêm 50ml dietyl ete vào cột a xít để rửa.
Lượng dietyl ete đủ được tách khỏi cột a xít bằng cách hút chân không trong 3 phút.
Caphein được tách khỏi cột a xít bằng 50ml clorofoc, dung dịch được tập trung vào bình định mức dung tích 100 ml và được điều chỉnh đến vạch bằng clorofoc trộn thật đều dung dịch thu được.
Chú thích: Phải điều chỉnh 2 van của 2 cột sao cho tốc độ chuyển dịch của chất lỏng (dietyl ete và clorofoc) không vượt quá 3 ml/phút. Đảm bảo chất lỏng phải thấm qua mọi vị trí của chất chứa trong cột. Không cho phép tạo thành bọt khí trong dòng chất lỏng.
5.5 Xác định độ hấp phụ
Đo độ hấp phụ của dung dịch thu được bằng máy quang phổ trong cuvét có chiều dày 1cm, dung dịch chuẩn là clorofoc tinh khiết đã bão hoà nước ở chiều dài bước sóng là 276nm. Từ giá trị đọc được trên máy quang phổ, dựa vào đường cong chuẩn để xác định hàm lượng caphein trong dung dịch đem phân tích.
6.1 Hàm lượng caphein (X) tính bằng phần trăm chất khô, tính theo công thức sau:
Trong đó:
c - nồng độ caphein trong dung dịch đem đo tính theo công thức đường cong chuẩn, g/ml;
mo - khối lượng mẫu, gam;
W - độ ẩm của cà phê, %.
6.2 Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 phép xác định song song.