RAU QUẢ VÀ SẢN PHẨM RAU QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAROTEN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP THÔNG DỤNG
Fruits, vegetables and derived products - Determination of carotene content - Part 2: Routine methods
Lời nói đầu
TCVN 9042-2:2012 hoàn toàn tương đương với ISO 6558-2:1992;
TCVN 9042-2:2012 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tổ chức biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
RAU QUẢ VÀ SẢN PHẨM RAU QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAROTEN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP THÔNG DỤNG
Fruits, vegetables and derived products - Determination of carotene content - Part 2: Routine methods
Tiêu chuẩn này quy định hai phương pháp thông dụng để xác định hàm lượng caroten (C40H56) sẵn có hoặc được bổ sung vào rau, quả và sản phẩm rau quả.
Phương pháp A dùng để xác định hàm lượng caroten trong các sản phẩm chứa hàm lượng chất béo nhỏ hơn hoặc bằng 5% khối lượng1).
Phương pháp B dùng để xác định hàm lượng caroten trong các sản phẩm chứa hàm lượng chất béo lớn hơn 5% khối lượng.
2.1. Nguyên tắc
Chiết caroten ra khỏi mẫu thử bằng hỗn hợp ete dầu mỏ và axeton. Loại bỏ axeton, tách caroten từ các carotenoid bằng sắc ký cột và xác định hàm lượng caroten bằng đo phổ.
2.2. Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
2.2.1. Ete dầu mỏ, có dải sôi trong khoảng từ 500C đến 700C.
2.2.2. Hỗn hợp chiết, được chuẩn bị như sau:
Hòa tan 0,2 g hydroquinon trong 40 ml axeton, sau đó thêm 160 ml ete dầu mỏ (2.2.1).
2.2.3. Natri sulfat, khan
Sấy ở nhiệt độ 1000C trong khoảng từ 2 h đến 3 h và giữ trong bình kín khí.
2.2.4. Cát thạch anh, đã rửa bằng axit và sấy khô trong lò nung.
2.2.5. Chất nhồi cột, sử dụng một trong các chất quy định trong 2.2.5.1 đến 2.2.5.4.
2.2.5.1. Nhôm oxit, đã khử hoạt tính bằng tạo huyền phù trong nước như sau:
Nung nhôm oxit 3 h trong lò nung ở nhiệt độ 5000C, để nguội và giữ trong tủ hút ẩm. Trước khi sử dụng, chuyển 50 g nhôm oxit đã chuẩn bị vào bình cầu có khớp nối thủy tinh mài, rồi thêm 5,5 ml nước và trộn kỹ cho đến khi thu được huyền phù đồng nhất. pH của huyền phù thu được nằm trong khoảng từ 9 đến 10. Huyền phù này khi được bảo quản trong bình đậy kín có thể bền trong 24 h.
2.2.5.2. Hỗn hợp magie oxit/bột thủy tinh, với tỷ lệ 1:2 (phần khối lượng).
2.2.5.3. Hỗn hợp nhôm oxit/natri sulfat khan, với tỷ lệ 3:1 (phần khối lượng).
2.2.5.4. Hỗn hợp nhôm oxit/canxi hydroxit, với tỷ lệ 1:1 (phần khối lượng).
2.2.6. Natri clorua, dung dịch 300 g/l.
2.3. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
2.3.1. Máy đo phổ, có thể đo được ở bước sóng 450 nm và được trang bị các cuvet có chiều dài đường quang 1 cm.
2.3.2. Dụng cụ lọc Witt, có phễu cổ nối mài bên trong, nắp đậy bằng thủy tinh mài và ống bên cạnh để lọc vào cốc có mỏ hoặc bình khác dưới áp suất giảm.
2.3.3. Bơm nước.
2.3.4. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì được ở nhiệt độ trong khoảng từ 300C đến 350C.
2.3.5. Bộ cô chân không.
2.3.6. Cột sắc ký, có đường kính trong khoảng từ 10 mm đến 15 mm.
2.3.7. Bộ lọc, loại P40.
2.3.8. Bông sợi, được nhúng trong ete dầu mỏ.
2.3.9. Cối và chày phòng thử nghiệm.
2.3.10. Bình hút ẩm, chứa chất hút ẩm hiệu quả.
2.3.11. Bình nón, dung tích 500 ml.
2.3.12. Bình cầu đáy tròn, dung tích 100 ml và 500 ml, có khớp nối thủy tinh mài.
2.3.13. Phễu chiết, dung tích 1000 ml.
2.3.14. Bình định mức một vạch, dung tích 50 ml và 100 ml.
2.4. Chuẩn bị mẫu thử
2.4.1. Sản phẩm không đồng nhất dạng lỏng (ví dụ: nước quả, nước cô đặc và xiro)
Trộn kỹ mẫu phòng thử nghiệm.
2.4.2. Sản phẩm dạng sánh (ví dụ: mứt nhuyễn và quả nước đường) và sản phẩm dạng rắn (ví dụ: quả và rau)
Loại bỏ các hạt và nếu cần thì bỏ phần vỏ cứng, sau đó trộn kỹ mẫu phòng thử nghiệm.
Cân tất cả các hạt, phần vỏ cứng… đã tách khỏi mẫu để hiệu chỉnh kết quả phân tích thu được.
2.4.3. Các sản phẩm đông lạnh và đông lạnh sâu
Rã đông mẫu phòng thử nghiệm trong bình kín. Thực hiện bước 2.4.2, nếu cần. Cho phần chất lỏng tạo thành trong quá trình rã đông vào sản phẩm và trộn kỹ.
2.5. Cách tiến hành
CHÚ Ý - Thực hiện phép phân tích ở nơi tối, tránh ánh sáng trực tiếp.
2.5.1. Phần mẫu thử
Cân một lượng (thường trong khoảng từ 1 g đến 10 g) mẫu thử đã chuẩn bị (2.4) có chứa khoảng từ 5 mg đến 150 mg caroten.
2.5.2. Chuẩn bị dung dịch thử
2.5.2.1. Chuyển định lượng phần mẫu thử vào cối (2.3.9) và thêm khoảng 20 ml hỗn hợp chiết (2.2.2). Thêm 20 g natri sulfat khan (2.2.3) và 30 g cát thạch anh (2.2.4) rồi nghiền kỹ. Gạn dịch chiết thu được qua bộ lọc (2.3.7) cho vào bình nón 500 ml (2.3.11). Lặp lại việc chiết cho đến khi thu được dịch chiết không màu, thu lấy dịch chiết đã lọc vào bình nón. Chuyển định lượng phần còn lại vào bộ lọc và rửa bằng hỗn hợp chiết, thu lấy nước rửa vào bình nón.
2.5.2.2. Chuyển hỗn hợp dịch chiết thu được sang phễu chiết 1 000 ml (2.3.13) và rửa vài lần với tất cả khoảng 300 ml đến 400 ml nước để loại hết axeton. Khuấy trộn cẩn thận dịch chiết để tránh tạo nhũ hóa. Nếu có tạo nhũ thì lặp lại việc chiết sử dụng phần mẫu thử khác và tiến hành quy trình rửa theo quy định trên, nhưng sử dụng dung dịch natri clorua 300 g/l (2.2.6) thay cho nước.
2.5.2.3. Cho 15 g natri sulfat khan (2.2.3) vào dịch chiết đã rửa, trộn và để yên 15 min. Chuyển dung dịch qua bộ lọc (2.3.7), làm đầy đến một nửa bình cầu đáy tròn 500 ml (2.3.12) bằng natri sulfat khan. Rửa natri sulfat ba lần, mỗi lần dùng 10 ml ete dầu mỏ (2.2.1), thu lấy nước rửa vào dịch lọc trong bình nón.
2.5.2.4. Cô đặc dịch lọc thu được ở trên trong bộ cô chân không (2.3.5) trên nồi cách thủy (2.3.4) đặt ở nhiệt độ trong khoảng từ 300C đến 350C, sau đó chuyển định lượng sang bình định mức một vạch 100 ml (hoặc 50 ml) (2.3.14) và thêm ete dầu mỏ (V1) đến vạch.
CHÚ THÍCH 1: Nếu tạo nhũ thì có thể bổ sung thêm 10 ml etanol.
2.5.3. Rửa giải
CHÚ Ý - Trong suốt quá trình rửa giải, cột phải luôn được làm đầy bằng ete dầu mỏ ở mức trên bề mặt của chất hấp phụ.
2.5.3.1. Chèn nút sợi bông đã tẩy nhờn (2.3.8) vào phía dưới cột sắt ký (2.3.6). Đặt cột lên thiết bị Witt (2.3.2) và trong khi vừa lắc nhẹ vừa cho huyền phù nhôm oxit đã khử hoạt tính (2.2.5.1), hoặc hỗn hợp magie oxit/bột thủy tinh (2.2.5.2), hoặc hỗn hợp nhôm oxit/natri sulfat khan (2.2.5.3) vào cột đến khoảng từ 15 cm đến 20 cm. Nhôm oxit không phải là chất hấp thụ thích hợp để tách các lycopen carotenoid. Khi phân tích các sản phẩm chứa lycopen (như cà chua và sản phẩm cà chua), thì dùng hỗn hợp nhôm oxit/canxi hydroxit (2.2.5.4) làm chất hấp phụ.
Sử dụng bình cầu đáy tròn 100 ml (2.3.12) làm bình thu nhận. Nối thiết bị Witt với bơm nước (2.3.3).
2.5.3.2. Đổ ete dầu mỏ vào đầy cột. Khi mức ete dầu mỏ hạ xuống khoảng 1 cm trên bề mặt chất hấp phụ thì cho thêm khoảng từ 5 ml đến 20 ml (được đong chính xác) dung dịch mẫu thử (V2) tùy thuộc vào cường độ màu của dung dịch. Khi dung dịch mẫu thử ở mức cao hơn bề mặt chất hấp phụ khoảng 1 cm thì thêm 30 ml ete dầu mỏ.
CHÚ THÍCH 2: Trong suốt quá trình rửa, a-, b- và g-caroten nằm phía dưới cột được nhận biết bằng vùng, có màu vàng và được rửa giải hết, còn các carotenoid (xanthophyl, crytoxanthin…) được giữ lại trong lớp phía trên của chất hấp phụ.
2.5.3.3. Tiến hành rửa giải cho đến khi dịch rửa giải không còn màu (thường là sau khi chảy hết khoảng 20 ml ete dầu mỏ).
2.5.3.4. Tùy thuộc vào cường độ màu của dịch rửa giải mà điều chỉnh thể tích của dịch rửa giải (cô đặc hoặc pha loãng bằng ete dầu mỏ, khi cần) sao cho 1 ml dịch rửa giải chứa khoảng từ 0,4 mg đến 3,0 mg caroten. Ghi lại thể tích cuối cùng của dịch rửa giải (V2).
2.5.4. Đo phổ
Tiến hành đo phổ của dịch rửa giải dựa vào ete dầu mỏ làm mẫu trắng, ở bước sóng 450 nm, dùng cuvet có chiều dài đường quang 1 cm.
Hệ số hấp thụ phân tử của dung dịch đối chứng b-caroten trong ete dầu mỏ ở bước sóng 450 nm là 2 530.
2.6. Biểu thị kết quả
Tính hàm lượng caroten, được biểu thị theo b-caroten, theo công thức:
w(C40H56) =
Trong đó:
w(C40H56) là hàm lượng caroten, tính bằng microgam trên gam sản phẩm (mg/g);
A là độ hấp thụ của dịch rửa giải;
V1 là thể tích dung dịch thử, tính bằng mililit (ml) (trong trường hợp này bằng 100 ml hoặc 50 ml);
V2 là thể tích dung dịch thử được sử dụng để phân tích sắc ký, tính bằng mililit (ml);
V3 là thể tích cuối cùng của dịch rửa giải, tính bằng mililit (ml);
0,25 là hệ số hiệu chỉnh đối với b-caroten;
m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).
3.1. Nguyên tắc
Xà phòng hóa phần mẫu thử bằng cách xử lý với dung dịch kali hydroxit trong cồn. Chiết các carotenoid bằng hỗn hợp ete dầu mỏ và dietyl ete, rồi xác định hàm lượng caroten bằng đo phổ.
3.2. Thuốc thử và vật liệu thử
Sử dụng các thuốc thử và vật liệu thử như quy định trong 2.2, trừ 2.2.2, 2.2.4 và 2.2.6, ngoài ra có sử dụng thêm các loại thuốc thử tinh khiết phân tích cụ thể sau:
3.2.1. Nitơ.
3.2.2. Etanol, dung dịch 96% thể tích.
3.2.3. Kali hydroxit, dung dịch 500 g/l.
Hòa tan trong nước cất 5,0g kali hydroxit đựng trong ống đong chia độ có nút đậy bằng thủy tinh mài, thêm nước đến 10 ml.
Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng.
3.2.4. Pyrogalol, dung dịch kiềm, được chuẩn bị như sau:
Chuẩn bị dung dịch pyrogalol 250 g/l bằng cách hòa tan 6,25 g pyrogalol trong nước đựng trong bình định mức một vạch 25 ml. Thêm nước đến vạch.
Chuẩn bị dung dịch kali hydroxit 600 g/l bằng cách hòa tan 60 g kali hydroxit trong nước đựng trong bình định mức một vạch 100 ml. Thêm nước đến vạch.
Chuẩn bị dung dịch kiềm bằng cách trộn 15 ml dung dịch pyrogalol với 90 ml dung dịch kali hydroxit.
3.2.5. Hỗn hợp chiết, được chuẩn bị như sau:
Trộn một phần ete dầu mỏ với 1 phần dietyl ete không chứa peroxit.
3.2.6. Kali hydroxit, dung dịch 30 g/l.
Hòa tan trong nước 1,5 g kali hydroxit trong nước đựng trong bình định mức một vạch 50 ml, thêm nước đến vạch.
3.2.7. Phenolphtalein, dung dịch 1%
Hòa tan 1,0 g phenolphtalein trong dung dịch etanol 60% thể tích và thêm etanol đến vạch.
3.2.8. Chất chống oxi hóa, ví dụ: pyrogalol, hydroquinon, axit ascorbic.
3.3. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ như quy định trong 2.3, trừ 3.9, 2.3.11 và 2.3.13 và cụ thể như sau:
3.3.1. Thiết bị xà phòng hóa, có dòng khí trơ đối lưu, được gắn với bình hấp thụ chứa dung dịch kiềm pyrogalol (3.2.4) để loại hết oxi ra khỏi dòng khí.
3.3.2. Phễu chiết, dung tích 250 ml.
3.4. Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo 2.4.
3.5. Cách tiến hành
3.5.1. Phần mẫu thử
Cân một lượng mẫu thử đã chuẩn bị (3.4) có chứa khoảng từ 5 mg đến 150 mg caroten cho vào bình cầu đáy tròn 100 ml (2.3.12).
3.5.2. Chuẩn bị dung dịch thử
3.5.2.1. Cho 30 ml dung dịch etanol (3.2.2), 3 ml dung dịch kali hydroxit (3.2.3) và một chút chất chống oxi hóa (3.2.8) vào phần mẫu thử, rồi nối bình cầu vào thiết bị xà phòng hóa (3.3.1). Mở dòng khí nitơ (3.2.1). Cho xà phòng hóa dưới dòng khí đối lưu, giữ dung dịch sôi trên nồi cách thủy 30 min.
3.5.2.2. Làm nguội hỗn hợp và chuyển định lượng vào phễu chiết 250 ml (3.3.2), rồi dùng 20 ml nước cất để tráng và cho luôn vào phễu chiết này. Chiết các chất không thể xà phòng hóa bằng cách khuấy trộn nhẹ hai lần với 50 ml và hai lần với 20 ml hỗn hợp chiết (3.2.5). Rửa kỹ dịch chiết thu được bằng 50 ml dung dịch kali hydroxit (3.2.6) và sau đó rửa bằng nước cất cho đến khi dịch chiết hết hẳn kiềm (dùng phenolphtalein để kiểm tra, xem 3.2.7).
3.5.2.3. Loại nước ra khỏi dịch chiết theo quy định trong 2.5.2.3.
3.5.2.4. Cô dịch chiết theo quy định trong 2.5.2.4.
3.5.3. Rửa giải và đo phổ
Tiến hành rửa giải và đo phổ theo quy định trong 2.5.3 và 2.5.4.
3.6. Biểu thị kết quả
Tính hàm lượng caroten biểu thị theo b-caroten, theo công thức nêu trong 2.6.
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác và sử dụng cùng một thiết bị trong cùng một khoảng thời gian ngắn như nhau, không được lớn hơn 5% giá trị trung bình của hai kết quả.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp thử đã dùng (nghĩa là Phương pháp A hoặc Phương pháp B) và kết quả thử nghiệm thu được. Báo cáo thử nghiệm cũng phải đề cập đến mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với mọi chi tiết bất thường có thể ảnh hưởng tới kết quả.
Báo cáo thử nghiệm cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.