TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 8766:2011
SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN - PHƯƠNG PHÁP NHUỘM DA CAM AXIT 12
Milk and milk products - Determination of protein content - Acid orange 12 dye-binding method
Lời nói đầu
TCVN 8766:2011 được xây dựng trên cơ sở AOAC 967.12 Protein in Milk. Dye Binding Method I;
TCVN 8766:2011 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Ống Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN - PHƯƠNG PHÁP NHUỘM DA CAM AXIT 12
Milk and milk products - Determination of protein content - Acid orange 12 dye-binding method
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng protein trong sữa và sản phẩm sữa bằng phương pháp nhuộm màu, sử dụng thuốc nhuộm da cam axit 12.
Phương pháp này có thể áp dụng cho sữa dạng lỏng, sữa bột gầy, hỗn hợp từ sữa và cream, kem lạnh, buttermilk và đồ uống từ sữa chứa socola.
2. Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:
Hàm lượng protein (protein content)
Phần khối lượng của protein xác định được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.
CHÚ THÍCH: Hàm lượng protein được biểu thị bằng phần trăm khối lượng.
3. Nguyên tắc
Khi nhuộm phần mẫu thử bằng dung dịch thuốc nhuộm da cam axit 12, một phần thuốc nhuộm sẽ liên kết với protein trong sữa, tạo thành phức chất protein nhuộm màu không hòa tan, phần còn lại không liên kết với protein và hòa tan vào dung dịch. Đo màu của dung dịch bằng máy đo phổ ở bước sóng 480 nm để tính phần khối lượng thuốc nhuộm không liên kết với protein. Hàm lượng protein được tính thông qua phần khối lượng thuốc nhuộm liên kết với protein.
4. Thuốc thử
Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. Nước được sử dụng phải là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương.
4.1. Dung dịch đệm phosphat, 0,05 M, pH từ 1,8 đến 1,9
Hòa tan 3,4 g kali dihydro phosphat (KH2PO4), 3,4 ml axit phosphoric (H3PO4) (hỗn hợp dung dịch axit phosphoric 85 % và nước với tỷ lệ 1:1), 60 ml axit axetic, 1 ml axit propionic và 2 g axit oxalic trong khoảng 800 ml nước. Thêm nước đến 1 000 ml và trộn.
4.2. Thuốc nhuộm da cam axit 12 [natri (5Z)-6-oxo-5-(phenylhydrazinyliden) naphthalen-2-sulfonat], đã tinh sạch 1)
Hòa tan 100 g thuốc nhuộm trong 400 ml nước sôi và khuấy trộn trong 400 ml cồn biến tính đang sôi. Làm mát đến nhiệt độ từ 0 oC đến 5 oC trong khoảng 15 h. Lọc hỗn hợp qua phễu Buchner, rửa một lần với cồn lạnh và rửa hút liên tục cho đến khi cồn được loại bỏ hết. Sấy khô ở 125 oC. Lặp lại quá trình kết tinh lại và sấy khô trong tủ sấy chân không ở 10 oC.
4.3. Dung dịch thuốc nhuộm 1)
4.3.1. Công thức 1
Hòa tan 1,300 g (đã được hiệu chỉnh theo 4.3.3) thuốc nhuộm da cam axit 12 (4.2), đã được kết tinh lại hai lần trong 1 000 ml dung dịch đệm phosphat 0,05 M (4.1).
4.3.2. Công thức 2
Hòa tan 1,320 g (đã được hiệu chỉnh theo 4.3.3) thuốc nhuộm da cam axit 12 (4.2), đã được kết tinh lại hai lần trong 1 000 ml dung dịch có chứa 60 ml axit axetic (CH3COOH) và 10 g axit oxalic (C2H2O4).
4.3.3. Hiệu chỉnh nồng độ thuốc nhuộm
Đo độ hấp thụ của dung dịch thuốc nhuộm, A, và tính nồng độ thuốc nhuộm trong dung dịch, c, sử dụng công thức:
trong đó:
b là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng milimet (mm).
Kiểm tra tiếp nồng độ của dung dịch dựa vào sữa đã biết hàm lượng protein hoặc dung dịch thuốc nhuộm màu đã được xác nhận giá trị sử dụng.
CHÚ THÍCH: Sử dụng cùng một công thức thuốc nhuộm cho phép thử và hiệu chuẩn.
4.4. Dung dịch thuốc nhuộm chuẩn 1)
Hòa tan 0,600 g thuốc nhuộm da cam axit 12 (4.2) đã được kết tinh lại hai lần và 1 axit propionic trong khoảng 900 ml nước. Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml. Hiệu chỉnh đối với phép thử như trong 4.3.3.
5. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1. Máy đo phổ, được cài đặt ở bước sóng 480 nm2) hoặc lại thích hợp.
5.2. Cuvet, có chiều dài đường quang ngắn
Cuvet với chiều dài đường quang khoảng 0,3 mm, kiểu dòng chảy là thích hợp. Đo độ hấp thụ As của dung dịch K2CrO4 0,0400 g/l trong kali hydroxit 0,05 M ở bước sóng 370 nm. Tính chiều dài đường quang, b, bằng milimet theo công thức:
b = As/0,09914
Lắp ống thoát và ống cấp phù hợp nếu có, theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo dòng chảy và các mức dịch lỏng.
5.3. Pipet tự động
Điều chỉnh để pipet phân phối tương đương 40,44 g dung dịch thuốc thử nhuộm màu ở 20 oC (tương ứng với 39.887 g nước hay 40 ml). Điều chỉnh sao cho khối lượng 10 lần phân phối liên tục đều nằm trong khoảng 40,44 g ± 0,02 g.
5.4. Xyranh
Chuẩn hóa xyranh lấy mẫu để phân phối 2,24 ml ở 20 oC (tương ứng 2,2337 g nước).
5.5. Túi đựng mẫu, làm bằng polyetylen.
5.6. Chai phân phối, loại quả bóp, được gắn nắp, làm bằng polyetylen có mặt phía trong bằng màng thủy tinh.
5.7. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,5 mg.
5.8. Bình định mức, dung tích 1 000 ml.
5.9. Tủ lạnh.
6. Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [1].
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
7. Cách tiến hành
7.1. Chuẩn bị mẫu thử
7.1.1. Sữa dạng lỏng và kem lạnh
Sử dụng luôn mẫu như khi nhận được.
7.1.2. Buttermilk, hỗn hợp từ sữa cream, đồ uống từ sữa chứa socola
Làm ấm mẫu đến nhiệt độ từ 35 oC đến 38 oC và khuấy trộn kỹ.
7.1.3. Sữa bột gầy
Sử dụng sản phẩm dạng bột hoặc hoàn nguyên như sau:
Cân túi bằng chất dẻo (5.5), chính xác đến 0,5 mg. Thêm khoảng 7,5 g và cân lại. Thêm tiếp khoảng 75 ml nước (ở khoảng 60 oC). Làm kín túi và lắc mạnh trong 3 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng và cân lại. Cho vào tủ lạnh để qua đêm. Hoàn nguyên phần mẫu thử mới của mẫu sữa bột gầy đối với từng phép thử lặp lại.
CHÚ THÍCH: Không sử dụng nồi cách thủy trong quá trình hoàn nguyên.
7.2. Dựng đường chuẩn
Sử dụng các dung dịch đệm thích hợp để pha loãng dung dịch thuốc nhuộm (4.3) đến nồng độ 0,350 g/l, 0,600 g/l, 0,750 g/l và 0,850 g/l.
Dựng đồ thị độ hấp thụ A dựa trên nồng độ của dung dịch thuốc nhuộm đã pha loãng.
7.3. Phép xác định
Chỉnh máy đo phổ về zero rồi điều chỉnh sao cho dung dịch thuốc nhuộm chuẩn (4.4) có số đọc 42 % T ở bước sóng 480 nm. Dùng xyranh (5.4) thêm một lượng phần mẫu thử vào chai phân phối (5.6):
- 2,24 ml đối với sữa, buttermilk hoặc hỗn hợp từ sữa và cream;
- từ 2,5 ml đến 2,8 ml đối với đồ uống từ sữa chứa socola hoặc sữa bột gầy hoàn nguyên;
- Từ 2,0 g đến 2,3 g đối với kem lạnh;
- từ 0,22 g đến 0,24 g đối với sữa bột gầy.
Dùng pipet tự động (5.3) thêm 40,44 g dung dịch thuốc nhuộm màu (4.3) vào chai phân phối (5.6). Lắc mạnh trong 30 s, riêng với chai phân phối có chứa sữa bột gầy thì lắc 3 min. Cài đặt lại số đọc của dung dịch thuốc nhuộm chuẩn (4.4) ở 42 %T, nếu cần. Nhỏ từng giọt dung dịch hỗn hợp từ chai phân phối (5.6) vào cuvet (5.2) qua phễu chiết. Khi số đọc đã ổn định, ghi lại số đọc chính xác đến 0,1 %. Kiểm tra số đọc của máy đo quang. Nếu đọc không đúng 42 % T với dung dịch thuốc nhuộm chuẩn (4.4) thì điều chỉnh lại thiết bị và lặp lại phép xác định trên phần mẫu thử.
Tất cả các dung dịch phải đưa về nhiệt độ 25 oC ± 1 oC trước khi đưa vào trong cuvet đo. Đo nhiệt độ trước khi lấy số đọc; làm ấm dung dịch trong dụng cụ đo.
8. Tính và biểu thị kết quả
8.1. Sữa dạng lỏng, sữa bột gầy đã hoàn nguyên, kem lạnh, buttermilk, hỗn hợp từ sữa và cream, đồ uống từ sữa chứa socola
8.1.1. Đối với dung dịch thuốc thử nhuộm màu công thức 1
Hàm lượng protein trong mẫu thử, X1, biểu thị bằng phần trăm khối lượng (%), được tính theo công thức sau:
trong đó:
m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
0,312 là số miligam thuốc nhuộm liên kết tương ứng với 1 mg protein;
1000 là hệ số chuyển đổi từ miligam sang gam;
m2 là khối lượng thuốc nhuộm liên kết, tính bằng miligam (mg), tính được theo công thức sau:
m2 = m3 - m1 = m3 - V x c1 = m3 -
Trong đó:
m0 là khối lượng dung dịch thuốc nhuộm (4.3), tính bằng gam (g). Trong trường hợp này, m0 = 40,44 g;
m3 là khối lượng thuốc nhuộm tổng số, tính bằng miligam (mg). Trong trường hợp này, m3 = 52 mg tương ứng với m0 = 40,44 g;
m1 là khối lượng thuốc nhuộm không liên kết, tính bằng miligam (mg);
c1 là nồng độ thuốc nhuộm không liên kết trong hỗn hợp, tính bằng miligam trên mililit (mg/ml). được tính từ đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ đọc được;
V là tổng thể tích của phần mẫu thử và dung dịch thuốc thử nhuộm màu được thêm vào, tính bằng mililit (ml);
1,012 là khối lượng riêng của hỗn hợp phần mẫu thử và dung dịch thuốc thử nhuộm màu được thêm vào, tính bằng gam trên mililit (g/ml).
8.1.2. Đối với dung dịch thuốc thử nhuộm màu công thức 2
Hàm lượng protein trong mẫu thử, X1, biểu thị bằng phần trăm khối lượng (%), được tính theo công thức sau:
Trong đó:
c2 là nồng độ thuốc nhuộm không liên kết trong hỗn hợp, tính bằng miligam trên mililit (mg/ml), được tính từ đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ đọc được.
8.2. Sữa bột gầy
Hàm lượng protein trong sữa bột gầy, X2, tính bằng phần trăm khối lượng (%), được tính theo công thức sau:
Trong đó:
X1 là hàm lượng protein trong sữa bột gầy đã hoàn nguyên, tính bằng phần trăm khối lượng, được tính theo 8.1;
m4 là khối lượng phần mẫu thử sữa bột gầy, tính bằng gam (g);
m5 là khối lượng phần mẫu thử sữa bột gầy đã hoàn nguyên, tính bằng gam (g).
9. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lẫy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.
[2] J.AOAC 50, 542, 557 (1967).
[3] J.AOAC 51, 811 (1968).
[4] J.AOAC 52, 138 (1969).
[5] J.AOAC 58, 773 (1975).
1) Có thể sử dụng sản phẩm có bán sẵn trên thị trường, ví dụ của Udy Crop., 201 Rome Ct, Fort Collins, CO 80524, USA. Thông tin này được đưa ra nhằn tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp nêu trên.
2) Có thể sử dụng máy đo màu phù hợp với cuvet dòng chảy, có chiều dài đường quang ngắn và đường chuẩn thích hợp, ví dụ của Udy Corp., 201 Rome Ct, Fort Collins, CO 80524, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp nêu trên.