Fish sause - Determination of urea content - Method using high-perfomance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection after derivatisation with xanthydrol
Lời nói đầu
TCVN 8025 : 2009 được xây dựng dựa trên dự thảo đề nghị của Trung tâm Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2;
TCVN 8025 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
NƯỚC MẮM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URÊ - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) DÙNG DETECTOR HUỲNH QUANG SAU KHI TẠO DẪN XUẤT VỚI XANTHYDROL
Fish sause - Determination of urea content - Method using high-perfomance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection after derivatisation with xanthydrol
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng urê trong nước mắm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dùng detector huỳnh quang sau khi tạo dẫn xuất với xanthydrol.
Phương pháp này áp dụng cho các loại nước mắm có hàm lượng urê lớn hơn hoặc bằng 0,010 g/l.
Urê có trong mẫu nước mắm được tạo dẫn xuất với xanthydrol (9H-xanthen-9-ol), tạo ra N-9H-xanthen-9-ylurea, dẫn xuất được phân tích trên thiết bị HPLC, dùng detector huỳnh quang với bước sóng kích hoạt 213 nm và bước sóng phát xạ 308 nm.
Tất cả thuốc thử đều phải đạt chất lượng cho phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng phải là nước cất hai lần hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có các quy định khác.
3.1 Urê, tinh khiết (≥ 99,6%).
3.2 Urê, dung dịch chuẩn
3.2.1 Dung dịch chuẩn gốc, 1 000 ppm
Cân 1 g urê tinh khiết (3.1), chính xác đến 0,0001 g, cho vào bình định mức 1 l (4.3). Hòa tan và pha loãng bằng nước đến vạch. Trộn đều.
3.2.2 Dung dịch chuẩn trung gian, 100 ppm.
Dùng pipet (4.4) lấy chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc (3.2.1) cho vào bình định mức 100 ml (4.3). Pha loãng bằng nước đến vạch.
3.2.3 Dung dịch chuẩn làm việc, 2 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm và 50 ppm.
Dùng pipet (4.4) lấy chính xác 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml và 50 ml dung dịch chuẩn trung gian (3.2.2), lần lượt cho vào từng bình định mức 100 ml (4.3). Pha loãng bằng nước đến vạch.
3.3 Propan-1-ol.
3.4 Axetonitril.
3.5 Etanol, 99,9%.
3.6 Xanthydrol, tinh khiết.
3.7 Dung dịch xanthydrol, 0,02 M.
Cân 0,3925 g xanthydrol (3.6) cho vào bình định mức 100 ml (4.3). Hòa tan và thêm propan-1-ol (3.3) đến vạch. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ từ 5oC đến 10oC, tránh ánh sáng.
3.8 Dung dịch natri axetat (CH3COONa), 0,02 M
Cân 1,64 g natri axetat cho vào bình định mức 1 000 ml (4.3). Hòa tan và thêm nước đến vạch.
3.9 Dung dịch axit clohydric (HCl) đậm đặc, d = 1,19.
3.10 Dung dịch axit clohydric (HCl), 1,5 M
Dùng pipet (4.4) lấy 12,4 ml dung dịch HCl (3.9), cho vào bình định mức 100 ml (4.3) và thêm nước đến vạch.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm bơm áp lực cao, dụng cụ bơm mẫu, detector huỳnh quang có bước sóng kích hoạt 213 nm và bước sóng phát xạ 308 nm, bộ tích hợp.
4.2 Cột phân tích HPLC, C18, 250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt trung bình khoảng 5 mm.
CHÚ THÍCH Chiều dài và đường kính của cột có thể được thay đổi theo kỹ thuật sử dụng HPLC.
4.3 Bình định mức, dung tích 100 ml và 1 000 ml.
4.4 Pipet, bằng thủy tinh, dung tích 1 ml, 2 ml, 5ml, 10 ml, 20 ml và 50 ml.
4.5 Thiết bị siêu âm.
4.6 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,0001 g.
4.7 Màng lọc, cỡ lỗ 0,45 mm.
4.8 Ống nghiệm, dung tích 15 ml có nắp đậy kín.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
Lắc đều mẫu trước khi thử nghiệm. Tùy theo hàm lượng urê có trong mẫu mà pha loãng mẫu bằng nước cất với hệ số pha loãng thích hợp (sao cho nồng độ urê có trong mẫu pha loãng nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn). Lọc mẫu trước khi tiến hành tạo dẫn xuất. Mẫu đã pha loãng chỉ sử dụng trong ngày.
5.2 Tạo dẫn xuất
5.2.1 Tạo dẫn xuất với chuẩn
Dùng pipet (4.4) lấy chính xác 1 ml các dung dịch chuẩn làm việc (3.2.3) cho vào từng ống nghiệm có nút đậy kín (4.8). Thêm chính xác 3 ml etanol (3.5) vào mỗi ống, lắc đều và lần lượt thêm 2 ml dung dịch xanthydrol (3.7), 1 ml dung dịch HCl (3.10). Đậy kín ống ,lắc đều, sau đó để yên ít nhất trong 5 min.
Lần lượt bơm các chuẩn đã được tạo dẫn xuất vào thiết bị HPLC (4.1).
5.2.2 Tạo dẫn xuất với mẫu
Tương tự như phần tạo dẫn xuất với chuẩn (5.2.1), nhưng thay các dung dịch chuẩn làm việc (3.2.3) bằng mẫu đã pha loãng thích hợp (5.1).
Quá trình tạo dẫn xuất có thể thực hiện trên bộ tiền dẫn xuất mẫu tự động của thiết bị.
5.3 Cách tiến hành
5.3.1 Điều kiện phân tích
a) Pha động
- Dung môi A: Axetonitril (3.4);
- Dung môi B: Axetonitril (3.4) và dung dịch natri axetat (3.8) (pH = 7,2) với tỷ lệ 36 : 64 (% thể tích);
- Lọc các dung môi pha động qua màng lọc (4.7) và loại bỏ khí hòa tan bằng cách để trong thiết bị siêu âm (4.5) khoảng 10 min trước khi sử dụng.
b) Bước sóng kích hoạt 213 nm, bước sóng phát xạ 308 nm.
c) Thể tích mẫu bơm: 20 ml;
d) Chương trình gradient pha động
Thời gian, min | Tốc độ dòng, ml/min | Dung môi A, % | Dung môi B, % |
0 | 1,3 | 0 | 100 |
8,00 | 1,3 | 0 | 100 |
8,01 | 1,3 | 100 | 0 |
12,00 | 1,3 | 100 | 0 |
12,01 | 1,3 | 0 | 100 |
30,00 | 1,3 | 0 | 100 |
CHÚ THÍCH Các thông số về tỉ lệ pha động, chương trình gradient pha động, thể tích mẫu bơm có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.
5.3.2 Dựng đường chuẩn
Sau khi thiết bị ổn định, tiến hành bơm lần lượt các chuẩn đã tạo dẫn xuất (5.2.1).
Xác định diện tích hoặc chiều cao pic của các chuẩn đã tạo dẫn xuất, dựng đường chuẩn.
5.3.3 Bơm mẫu
Bơm mẫu đã tạo dẫn xuất (5.2.2) với cùng điều kiện như bơm chuẩn.
Dựa vào đường chuẩn, xác định hàm lượng urê có trong mẫu.
Nếu diện tích pic hoặc chiều cao pic của dẫn xuất mẫu lớn hơn diện tích pic hoặc chiều cao pic của dẫn xuất chuẩn cao nhất, thì phải tiến hành pha loãng mẫu với độ pha loãng lớn hơn (5.1) rồi lặp lại quá trình tạo dẫn xuất mẫu và bơm mẫu.
Tính hàm lượng urê có trong mẫu nước mắm, X, biểu thị bằng gam trên lít, theo công thức sau đây:
X = Cm x kpl
trong đó
Cm là hàm lượng urê có trong mẫu đã pha loãng được tính dựa và đường chuẩn, tính bằng gam trên lít;
kpllà hệ số pha loãng.
Lấy kết quả chính xác đến ba chữ số sau dấu phẩy.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.
- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] SHONA CLARK, PAUL S.FRANCIS, XAVIER A.CONLAN, NEIL W.BARNETT, Determination of urea using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection after automated derivatisation with xanthydrol, J. of Chromatography A. 1161 (2007), p. 207-213.