ISO 13722:2017
VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - ĐỊNH LƯỢNG BROCHOTHRIX SPP. - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC
Microbiology of the food chain - Enumeration of Brochothrix spp. - Colony-count technique
Lời nói đầu
TCVN 7139:2018 thay thế TCVN 7139:2002;
TCVN 7139:2018 hoàn toàn tương đương với ISO 13722:2017;
TCVN 7139:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - ĐỊNH LƯỢNG BROCHOTHRIX SPP. - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC
Microbiology of the food chain - Enumeration of Brochothrix spp. - Colony-count technique
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Brochothrix spp. bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc.
Tiêu chuẩn này áp dụng cho thịt và các sản phẩm thịt, nhưng cũng thích hợp để xác định:
- các sản phẩm thực phẩm khác;
- các sản phẩm thức ăn chăn nuôi;
- các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất, xử lý thực phẩm và thức ăn chăn nuôi;
- các mẫu thu được từ giai đoạn sản xuất ban đầu.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6404 (ISO 7218), Visinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật
TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật
TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng củamôi trường nuôi cấy
Trong tiêu chuẩn này sử dụng ngữ và định nghĩa sau đây:
3.1
Brochothrix spp. (Brochothrix spp.)
Vi khuẩn gram dương tạo thành các khuẩn lạc oxidase âm tính và catalase dương tính đặc trưng trên môi trường đặc chọn lọc [thạch streptomyxin sulfat/tali axetat (STAA)] trong các điều kiện thử nghiệm quy định của tiêu chuẩn này.
CHÚ THÍCH 1: Cho đến nay chỉ phát hiện hai loài Brochothrix là Br. thermosphacta và Br. campestris. Br. thermosphacta trong thịt và sản phẩm thịt, còn Br. campestris chỉ tìm thấy trong các mẫu đất và cỏ [9],[10]. Phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này không thể phân biệt hai loài này.
4.1 Cấy một lượng mẫu thử quy định nếu sản phẩm dạng lỏng hoặc một lượng quy định huyền phù ban đầu nếu sản phẩm dạng khác lên đĩa môi trường nuôi cấy đặc chọn lọc, đựng trong các đĩa Petri. Trong điều kiện tương tự, chuẩn bị các đĩa khác sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
4.2 Ủ các đĩa ở nhiệt độ từ 22 °C đến 25 °C trong 48 h.
4.3 Lấy các khuẩn lạc để thử khẳng định.
4.4 Từ số khuẩn lạc đã khẳng định, tính số lượng Brochothrix spp. có trong 1 mL, hoặc trong 1 g mẫu theo số khuẩn lạc thu được trên các đĩa, ở các mức pha loãng được chọn sao cho đạt kết quả tin cậy nhất.
5 Môi trường nuôi cấy và thuốc thử
Theo thực hành phòng thử nghiệm hiện hành như quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218).
Thực hiện thử nghiệm hiệu năng của môi trường nuôi cấy như quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133).
Thành phần của môi trường nuôi cấy, thuốc thử và tiến hành chuẩn bị được quy định trong Phụ lục A.
Có thể dùng các dụng cụ dùng một lần để thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu phù hợp. Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường như quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218) và cụ thể như sau:
6.1 Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).
6.2 Tủ ấm hoặc tủ sấy, có khả năng hoạt động ở nhiệt độ từ 25 °C đến 50 °C.
6.3 Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở nhiệt độ từ 22 °C đến 25 °C.
6.4 Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.
6.5 Máy đo pH, có độ chính xác trong khoảng ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.
6.6 Que cấy gạt, dài khoảng 20 cm một đầu được uốn cong rộng khoảng 3 cm.
6.7 Pipet chia vạch xả hết, dung tích danh định 1 ml, được chia vạch 0,1 ml hoặc pipet tự động.
6.8 Nồi cách thủy, có khả năng duy trì ở 47 °C ± 2 °C.
6.9 Que cấy vòng bằng platin, hoặc đũa thủy tinh hoặc đũa được làm bằng chất dẻo, đường kính khoảng 3 mm.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, xem tiêu chuẩn cụ thể phù hợp cho sản phẩm có liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên liên quan cần thỏa thuận về vấn đề này.
Các kỹ thuật lấy mẫu được khuyến cáo nêu trong:
TCVN 11923 (ISO/TS 17728)[3] đối với thực phẩm và thức ăn chăn nuôi;
TCVN 10782 (ISO 13307)[1] đối với giai đoạn sản xuất ban đầu;
TCVN 7925 (ISO 17604) [2] đối với thân thịt;
TCVN 8129 (ISO 18593)[4] đối với các mẫu môi trường.
Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Chuẩn bị mẫu thử từ mẫu phòng thử nghiệm theo tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Xem TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc các tiêu chuẩn cụ thể phù hợp cho sản phẩm có liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên có liên quan cần thỏa thuận về vấn đề này.
9.1 Phần mẫu thử, huyền phùban đầu và các dung dịch pha loãng
Thực hiện theo phần có liên quan của TCVN 6507 (ISO 6887).
9.2 Cấy và ủ
9.2.1 Dùng pipet vô trùng (6.7) chuyển 0,1 ml mẫu thử nếu sản phẩm dạng lỏng hoặc huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm ở dạng khác, sang đĩa thạch STAA (A.2.5). Lặp lại quy trình này với các độ pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần. Nếu chỉ sử dụng huyền phù ban đầu thì cũng cần chuẩn bị hai đĩa, dùng một đĩa bổ sung.
9.2.2 Dùng que cấy dàn đều chất lỏng trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt tránh để không chạm que (6.6) vào cạnh của đĩa. Đối với mỗi đĩa sử dụng một que mới. Đậy nắp đĩa và để trong khoảng 15 min ở nhiệt độ môi trường cho chất lỏng hấp thụ vào thạch.
9.2.3 Lật úp các đĩa đã chuẩn bị (9.2.2) và ủ trong tủ ấm (6.3) trong vòng 48 h ± 4 h ở nhiệt độ từ 22 °C đến 25 °C.
9.3 Đếm khuẩn lạc
Sau khi kết thúc thời gian ủ quy định (9.2.3), đếm các khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa chứa từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Các khuẩn lạc điển hình bóng, tròn hoặc các khuẩn lạc tròn có đường kính 1 mm hoặc lớn hơn, có màu trắng nhạt.
9.4 Khẳng định
9.4.1 Yêu cầu chung
Thông tin chung về các phép thử khẳng định, xem TCVN 6404 (ISO 7218).
Chọn 5 khuẩn lạc từ đĩa Petri chứa từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc điển hình (9.3). Tiến hành phép thử oxidase (9.4.2) và phép thử catalase (9.4.3) đối với từng khuẩn lạc để khẳng định là Brochothrix spp.
9.4.2 Phép thử oxidase
Pseudomonas có thể mọc trên môi trường STAA. Chúng phải được phân biệt với Brochothrix spp. bằng phép thử oxidase như sau:
Làm ẩm mảnh giấy lọc bằng thuốc thử oxidase (A.3). Dùng que cấy vòng platin hoặc đũa thủy tinh hoặc đũa bằng chất dẻo (6.9) (que cấy vòng bằng niken/crom cho kết quả dương tính giả) lấy mẫu các khuẩn lạc từ môi trường STAA và phết lên giấy lọc đã được làm ẩm. Các khuẩn lạc oxidase dương tính xuất hiện màu đỏ tía trong vòng 15 s. Brochothrix spp. có phản ứng oxidase âm tính.
9.4.3 Phép thử catalase
Các vi khuẩn axit lactic nhất định có thể tạo các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường STAA. Phân biệt vi khuẩn axit lactic với Brochothrix spp. bằng phép thử catalase như sau:
Đối với mỗi khuẩn lạc được chọn, đặt một vòng cấy vi khuẩn vào một giọt dung dịch hydro peroxit (A.4) trên phiến kính sạch. Phép thử dương tính nếu xuất hiện bọt khí trong vòng 30 s. Brochothrix spp. cho phản ứng catalase dương tính.
Biểu thị kết quả theo TCVN 6404 (ISO 7218).
Tính và báo cáo số đếm Brochothrix spp. bằng cfu/g hoặc cfu/ml.
11 Đặc tính hiệu năng của phương pháp
11.1 Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm
Phương pháp NMKL đã được xác nhận giá trị sử dụng trong một nghiên cứu cộng tác[8]. Dữ liệu thu được từ nghiên cứu báo cáo trong tiêu chuẩn này đã được sự đồng ý của NMKL (Ủy ban phân tích thực phẩm Bắc Âu).
Mười lăm phòng thử nghiệm đã phân tích 10 mẫu cấy chủng Br. thermosphacta đông khô được trộn lẫn với hệ vi khuẩn chưa biết từ thịt hoặc cá. Các phòng thử nghiệm tham gia đã phân tích các mẫu sử dụng phương pháp nêu trong tiêu chuẩn NMKL, mà không sử dụng phép thử khẳng định catalase với các khuẩn lạc điển hình.
11.2 Giới hạn lặp lại và tái lập
Các kết quả của nghiên cứu đã cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt, độ lệch chuẩn 0,13 cfu/g. Độ tái lập của phương pháp có độ lệch chuẩn là 0,22 cfu/g.
CHÚ THÍCH: Nghiên cứu liên phòng do NMKL thực hiện không bao gồm bất kỳ chủng Br. campestris nào.
Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:
- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
- mọi sai lệch về môi trường nuôi cấy hoặc các điều kiện ủ đã sử dụng;
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- kết quả thử nghiệm thu được.
Môi trường nuôi cấy và thuốc thử
A.1 Yêu cầu chung
Áp dụng các yêu cầu chung trong TCVN 8128 (ISO 11133) để chuẩn bị và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy quy định trong Phụ lục này. Nếu môi trường nuôi cấy hoặc thuốc thử được chuẩn bị từ các môi trường/thuốc thử hoàn chỉnh khô hoặc nếu sử dụng môi trường/thuốc thử có bán sẵn thì cần tuân thủ các hướng dẫn của nhà sử dụng, liên quan đến chuẩn bị, bảo quản hạn sử dụng và cách sử dụng.
Thời hạn sử dụng của môi trường chỉ rõ trong phụ lục này đã được nêu trong một vài nghiên cứu. Người sử dụng cần kiểm tra xác nhận chúng trong các điều kiện bảo quản của mình [xem TCVN 8128 (ISO 11133)].
A.2 Môi trường đặc chọn lọc: Thạch streptomixin sulfat/tali axetat (STAA)
A.2.1 Môi trường cơ bản
A.2.1.1 Thành phần
Công thức ban đầu[6,7] đối với STAA bao gồm cycloheximid (actidion) 50 µg/ml. Hợp chất này độc và do đó bị bỏ qua, mặc dù trên thị trường vẫn còn một phần môi trường khô hoặc được bán sẵn. Khi dự kiến nấm men và/hoặc nấm sợi quá cao thì nên sử dụng hợp chất kháng nấm ít độc hơn như amphotericin B (10 µg/ml).
Sản phẩm thủy phân tế bào động vật bằng enzym | 20,0 g |
Chất chiết nấm men | 2,0 g |
Glyxerol | 15,0 g |
Dikali hydro phosphat (K2HPO4) | 1,0 g |
Magie sulfat ngậm 7 phân tử nước (MgSO4.7H2O) | 1,0 g |
Thạcha | 9 g đến 18 g |
Nước | 900 ml |
a Tùy vào sức đông của thạch. |
|
A.2.1.2 Chuẩnbị
Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C.
Khử trùng môi trường trong nồi hấp áp lực (6.1) 15 min ở 121 °C.
A.2.2 Dung dịch streptomyxin sulfat
A.2.2.1 Thành phần
Streptomyxin sulfat | 1,0 g |
Nước | 100 ml |
A.2.2.2 Chuẩn bị
Hòa tan streptomyxin sulfat trong nước. Lọc để khử trùng.
A.2.3 Dung dịch tali axetat
CẢNH BÁO - Tali axetat là chất cực độc. Khi làm việc với các hóa chất và các dung dịch của chúng phải thực hiện các quy trình thích hợp để tránh bị nhiễm sang người thực hiện và môi trường.
A.2.3.1 Thành phần
Tali axetat | 250 g |
Nước | 100 ml |
A.2.3.2 Chuẩn bị
Hòa tan tali axetat trong nước. Lọc để khử trùng.
A.2.4 Môi trường hoàn chỉnh
A.2.4.1 Thành phần
Môi trường cơ bản (A.2.1) | 900 ml |
Dung dịch streptomyxin sulfat (A.2.2) | 50 ml |
Dung dịch tali axetat (A.2.3) | 20 ml |
A.2.4.2 Chuẩn bị
Làm tan chảy môi trường cơ bản và để nguội trong nồi cách thủy (6.8) ở nhiệt độ 47 °C. Trong điều kiện vô trùng, làm ấm các phần dung dịch khác (A.2.2 và A.2.3) đến 47 °C trong nồi cách thủy. Cho thêm các lượng thể tích quy định (A.2.4.1) của các dung dịch này vào môi trường đã làm ấm và để nguội, trộn kỹ giữa các lần thêm.
A.2.5 Chuẩn bị đếm thạch đĩa
Rót từ 15 ml đến 20 ml môi trường hoàn chỉnh (A.2.4) vào các đĩa Petri vô trùng (6.4), để yên cho đặc lại. Các đĩa này có thể được bảo quản mà không cần làm khô trong 1 tuần ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C. Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp ra và lật úp đĩa thạch, đặt vào tủ ấm (6.2) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 50 °C, cho đến khi không còn nước trên bề mặt môi trường. Sau đó không làm khô thêm nữa. Có thể hé một nửa nắp các đĩa thạch và làm khô trong tủ sấy 30 min hoặc đậy nguyên nắp và để qua đêm. Các đĩa thạch đã được chuẩn bị có bán sẵn. Bảo quản và sử dụng các đĩa này theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.2.6 Thử hiệu năng của thạch streptomyxin sulfat/tali axetat (STAA)
Về định nghĩa hiệu suất, tính chọn lọc và phương pháp kiểm soát, xem TCVN 8128 (ISO 11133).
Về phép thử hiệu năng của STAA, xem Bảng A.1.
Bảng A.1 - Phép thử hiệu năng về đảm bảo chất lượng STAA
Môitrường | Chức năng | Ủ | Chủng kiểm chứng | Số WDCMa | Phương pháp kiểm soát | Tiêu chí |
STAA | Năng suất | 48 h ± 4 h 22 °C đến 25 °C | Brochothrixthermosphacta | 00071 | Định tính | Phát triển tốtc |
| Độ chọn lọc | 48 h ± 4 h 22 °C đến 25 °C | Enterococcusfaecalis | 00009b | Định tính | Ức chế một phần hoặc hoàn toàn (0-1)c |
|
|
| Lactobacillussakei | 00015b |
|
|
a Tham khảo catalog chủng trên http://www.wfcc.info về thông tin số lượng chủng cấy và chi tiết liên hệ: WDCM: Trung tâm dữ liệu thế giới về vi sinh vật. b Chủng tối thiểu được sử dụng (xem Tài liệu viện dẫn [5]). c Phân loại sự phát triển: 0: không phát triển, 1: phát triển kém (ức chế một phần), 2: phát triển tốt [(xem TCVN 8128 (ISO 11133)] | ||||||
A.3 Thuốc thử oxidase
A.3.1 Thành phần
N,N, N’, N’-Tetrametyl-p-phenylenediamin dihydroclorua | 1,0 g |
Nước | 100 ml |
A.3.2 Chuẩn bị
Hòa tan thuốc thử trong nước lạnh. Thuốc thử phải được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng.
Có thể sử dụng các đĩa hoặc các que cấy bán sẵn. Trong trường hợp này sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
A.4 Thuốc thử catalase
A.4.1 Thành phần
Hydro peroxit | 0,3 g |
Nước | 9,3 ml |
A.4.2 Chuẩn bị
Chuẩn bị dung dịch hydro peroxit 3 % (khối lượng). Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ từ 20 °C đến 30 °C, tránh ánh sáng trực tiếp.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] TCVN 10782 (ISO 13307) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Giai đoạn sản xuất ban đầu - Kỹ thuật lấy mẫu
[2] TCVN 7925 (ISO 17604) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu thân thịt tươi để phân tích vi sinh vật
[3] TCVN 11923 (ISO/TS 17728) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Kỹ thuật lấy mẫu để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
[4] TCVN 8129 (ISO 18593) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu bề mặt sử dụng đĩa tiếp xúc và lau bề mặt
[5] J.E.L. Corry, G.D.W. Curtis, R.M. Baird (Eds.) Handbook of culture media for food and water microbiology, 3rd Edition. Royal Society of Chemistry, www.rsc.org
[6] G.A. Gardner A selective medium for the enumeration of Microbacterium thermosphactum in meat and meat products. J. Appl. Bacteriol. 1966, 29 (3) pp. 455-460
[7] G.A. Gardner Streptomycin-thallous acetate-actidione (STAA) agar: a medium for the selective enumeration of Brochothrix thermosphacta. Int. J. Food Microbiol. 1985, 2 (1-2) pp. 69-70
[8] NORDIC COMMITTEE ON FOOD ANALYSIS. NMKL Method No. 141, 3rd ed., 2010. Brochothrix spp. Enumeration in meat and meat products.
[9] R. Talon, P.A.D. Grimont, F. Grimont, F. Gasser, J.M. Boeufgras Brochothrix campestris sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 1988, 38 pp. 99-102
[10] Y.Z. Xu, A. Anyogu, L.I.I. Ouoba, J.P. Sutherland Genotypic characterization of Brochothrix spp. isolated from meat, poultry and fish. Lett. Appl. Microbiol. 2010, 51 pp. 245-251