TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 12611:2019
NƯỚC QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT QUINIC, AXIT MALIC VÀ AXIT XITRIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Fruit juice - Determination of quinic, malic and citric acids content by high performance liquid chromatographic method
Lời nói đầu
TCVN 12611:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 986.13 Quinic, malic, citric acids in cranberry juice cocktail and apple juice. Liquid chromatographic method;
TCVN 12611:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
NƯỚC QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT QUINIC, AXIT MALIC VÀ AXIT XITRIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Fruit juice - Determination of quinic, malic and citric acids content by high performance liquid chromatographic method
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo để xác định hàm lượng axit quinic, axit malic và axit xitric trong nước quả.
2 Nguyên tắc
Nước quả được đưa qua cột làm sạch để loại bỏ các chất gây nhiễu, được lọc và bơm vào hệ thống sắc ký lỏng. Axit quinic, axit malic và axit xitric được tách bằng việc sử dụng hai cột sắc ký lỏng pha đảo ghép nối với detector UV ở bước sóng 214 nm. Các axit được định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn.
3 Thuốc thử
Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng phải là nước đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.
3.1 Axetonitril (CH3CN).
3.2 Metanol (CH3OH).
3.3 Kali dihydrophosphat (KH2PO4).
3.4 Axit ortho-phosphoric (H3PO4), 85 %.
3.5 Các chất chuẩn: axit quinic, axit malic, axit xitric.
3.6 Pha động cho sắc ký lỏng, đệm phosphat 0,2 M, pH 2,4
Cân chính xác 27,2 g kali dihydrophosphat (3.3) vào cốc có mỏ 1 000 ml, thêm nước cất đến khoảng 950 ml. Dùng máy đo pH (4.7) và axit ortho-phosphoric (3.4) chỉnh đến pH 2,4. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1 000 ml (4.7), thêm nước đến vạch và lọc, sử dụng bộ lọc dung môi (4.5).
3.7 Các dung dịch chuẩn làm việc
Cân 0,200 g mỗi chất chuẩn (3.5), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 100 ml (4.8). Định mức đến vạch bằng nước và lọc.
4 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Hệ thống sắc ký lỏng, được trang bị bộ bơm mẫu, detector có thể thay đổi được bước sóng, có thể hoạt động tại 214 nm, và bộ phân tích dữ liệu.
4.2 Cột phân tích, bao gồm cột Supelcosil LC-C-18 hoặc tương đương, cỡ hạt 5 µm, kích thước 250 mm x 4,6 mm ghép nối với cột Radial-Pak C-18, cỡ hạt 5 µm, chiều dài 10 cm được sử dụng ở chế độ "Radial compression module". Cột Radial-Pak C18 có thể được thay thế bởi cột pha đảo C18 kích thước 25 cm hoặc 30 cm với cỡ hạt 10 µm. Đầu cột Supelcosil LC-C18 được nối với cột bảo vệ Bio-Rad ODS-10.
4.3 Cột làm sạch SPE, Sep-Pak C18.
4.4 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.5 Bộ lọc dung môi sắc ký, sử dụng màng nylon cỡ lỗ 0,45 µm.
4.6 Máy đo pH.
4.7 Bình định mức, dung tích 100 ml và 1 000 ml.
4.8 Màng lọc mẫu, bằng PTFE, kích thước 13 mm, cỡ lỗ 0,45 µm.
4.9 Lọ đựng mẫu cho HPLC, có nắp vặn được phủ teflon.
4.10 Xyranh, dung tích 10 ml.
5 Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.
Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
6 Cách tiến hành
6.1 Chuẩn bị mẫu thử
Lắc đều mẫu trước khi phân tích.
6.2 Chuẩn bị dung dịch thử
Hoạt hóa cột chiết pha rắn (4.3) bằng 10 ml hỗn hợp axetonitril và nước (50 : 50 phần thể tích) sử dụng xyranh (4.10). Tháo xyranh và đẩy 10 ml không khí qua cột. Nạp 10 ml phần mẫu thử (6.1) qua cột đã được hoạt hóa, bỏ đi từ 4 ml đến 5 ml dịch mẫu qua cột đầu tiên, thu lấy từ 4 ml đến 5 ml dung dịch mẫu tiếp theo. Lọc dịch mẫu qua màng lọc (4.8) vào lọ đựng mẫu (4.9) chuẩn bị cho phân tích sắc ký.
6.3 Xác định
6.3.1 Điều kiện vận hành sắc ký lỏng
- Pha động: đệm phosphat 0,2 M, pH 2,4 (3.6), chế độ đẳng dòng;
- Detector: UV, bước sóng 214 nm;
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/min;
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng;
- Độ nhạy: 0,1 AUFS.
CHÚ THÍCH: Các thông số về thể tích mẫu bơm, tốc độ dòng, nhiệt độ cột có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.
6.3.2 Ổn định hệ thống
Ổn định hệ thống với 100 % metanol (3.2) hoặc hỗn hợp metanol và nước (70 : 30, phần thể tích), sau đó với nước và tiếp theo là đệm phosphat (3.6). Đảo ngược lại thứ tự khi kết thúc ngày làm việc.
LƯU Ý: Tránh tuyệt đối metanol bị trộn lẫn với đệm phosphat.
Cân bằng cột đạt yêu cầu phân tích khi có sự phân tách giữa pic của đường và pic của axit quinic trong mẫu thử.
6.3.3 Tiến hành phân tích
Bơm 5 µl đến 20 µl dung dịch chuẩn (3.7) cứ sau 2 lần bơm mẫu để kiểm tra sự tuyến tính.
Bơm 5 µl dung dịch thử (6.2).
Sử dụng tín hiệu trung bình của 2 lần bơm chuẩn và mẫu tương ứng.
Thứ tự rửa giải mẫu: axit quinic, axit malic, axit xitric, axit fumaric.
CHÚ THÍCH: Chất chuẩn axit malic (L-malic hoặc D-L-malic) sẽ có 2 pic, pic thứ 2 tương ứng là axit fumaric. Hàm lượng axit fumaric rất nhỏ trong dung dịch chuẩn. Với chất chuẩn có độ tinh khiết ≥ 99,9 % được coi là không chứa axit fumaric và tạp chất nên không ảnh hưởng đến phép phân tích. Nước quả nam việt quất có bổ sung vitamin C có pic lớn xuất hiện sau pic của malic do đồng rửa giải của axit ascorbic và axit shikimic.
7 Tính kết quả
Hàm lượng các axit trong mẫu thử, Xi, biểu thị bằng gam trên 100 ml (g/100 ml), được tính theo công thức sau:
Trong đó:
PA, PA’ lần lượt là diện tích của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn;
V, V’ lần lượt là thể tích của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn, tính bằng mililit (ml);
C là nồng độ của dung dịch chuẩn, tính bằng gam trên 100 ml (g/100 ml).
8 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
Phụ lục A
(tham khảo)
Sắc ký đồ của mẫu nước quả nam việt quất
CHÚ DẪN:
(1) dung môi và đường;
(2) axit quinic;
(3) axit malic;
(4) axit ascorbic và một số axit shikimic;
(5) axit xitric
Hình A.1 - Sắc ký đồ mẫu nước quả nam việt quất