TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 12610:2019
NGŨ CỐC CÓ BỔ SUNG ĐƯỜNG - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSE, FRUCTOSE, SUCROSE VÀ MALTOSE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Presweetened cereals -Determination of glucose, fructose, sucrose and maltose content by high performance liquid chromatographic method
Lời nói đầu
TCVN 12610:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 982.14 Glucose, fructose, sucrose and maltose in presweetened cereals. Liquid chromatographic method;
TCVN 12610:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
NGŨ CỐC CÓ BỔ SUNG ĐƯỜNG - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSE, FRUCTOSE, SUCROSE VÀ MALTOSE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Presweetened cereals -Determination of glucose, fructose, sucrose and maltose content by high performance liquid chromatographic method
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector chỉ số khúc xạ để xác định hàm lượng glucose, fructose, sucrose và maltose trong các sản phẩm ngũ cốc có bổ sung đường.
2 Nguyên tắc
Các loại đường trong mẫu được chiết bằng nước, được làm sạch qua cột để loại bỏ các chất gây nhiễu, được tách và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng với detector chỉ số khúc xạ.
3 Thuốc thử
Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng là nước đã loại ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.
3.1 Axetonitril (CH3CN), tinh khiết LC.
3.2 Etanol (C2H5OH).
3.3 Ete dầu hỏa.
3.4 Các chất chuẩn: glucose, fructose, sucrose, maltose, ví dụ từ Sigma Chemical Co.1)
3.5 Pha động cho sắc ký lỏng, hỗn hợp axetonitril và nước (tỷ lệ thể tích 80 : 20)
Lọc dung dịch qua màng lọc thủy tinh Whatman GF/F 0,7 µm hoặc màng lọc nilon 66 cỡ lỗ 0,45µm. Có thể lọc riêng axetonitril và nước lần lượt qua màng lọc PTFE và cellulose. Loại khí trong bể rung siêu âm (4.5) trước khi sử dụng.
CHÚ THÍCH: Tỷ lệ của axetonitril : nước và tốc độ dòng có thể thay đổi cho phù hợp để đáp ứng với yêu cầu của cột sắc ký
3.6 Dung dịch chuẩn
Sấy riêng rẽ từng chất chuẩn đường (3.4) với thời gian 12 h tại 60 °C trong chân không, hòa tan trong hỗn hợp etanol và nước (tỷ lệ thể tích 1 : 1) để có được nồng độ 3 mg/ml đối với fructose, glucose, maltose và 15 mg/ml đối với sucrose.
CHÚ THÍCH: Sau khi phân tích sắc ký, so sánh tín hiệu của mẫu thử và chất chuẩn. Điều chỉnh nồng độ dung dịch chuẩn sao cho tín hiệu của chuẩn sai lệch trong khoảng 10 % so với tín hiệu mẫu thử.
3.7 Dung dịch Triethylenephosphoramide (TEPA), 0,1 % trong hỗn hợp axetonitril và nước (3.5)
3.8 Axit axetic đặc hoặc dung dịch axit axetic có nồng độ thích hợp
4 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, có bộ bơm mẫu tự động, detector chỉ số khúc xạ và bộ ghi.
4.2 Cột sắc ký, cột amino chiều dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm hoặc tương đương. Cột cần đạt các tiêu chí sau đây:
a) Hệ số dung tích đối với frucose không nhỏ hơn 1,5.
Hệ số dung tích đối với frucose, K’, được tính theo Công thức (1):
(1)
Trong đó:
tR là thời gian lưu của fructose, là thời gian tính từ lúc bơm mẫu cho đến khi pic fructose đạt chiều cao cực đại;
t0 là thời gian lưu của dung môi, là thời gian từ lúc bơm mẫu cho đến khi pic nhiễu đường nền hoặc pic dung môi đạt chiều cao cực đại.
b) Hệ số phân giải (Rs):
Rs≥ 1,0 khi tỉ lệ fructose : glucose từ 0,5 đến 2,0.
Rs≥ 1,25 khi tỉ lệ fructose : glucose ≥ 2.
Hệ số phân giải là khoảng cách giữa 2 đỉnh pic chia cho độ rộng trung bình của 2 pic, được tính theo Công thức (2):
(2)
Trong đó:
t2 và t1 lần lượt là thời gian từ lúc bơm mẫu cho đến khi pic thứ hai (glucose) và pic thứ nhất (fructose) đạt chiều cao cực đại;
tw1 và tw2 lần lượt là độ rộng chân pic (tính theo thời gian) của pic thứ nhất và pic thứ hai.
4.3 Cột lọc, có chiều dài 100 mm, đường kính trong 2 mm hoặc cột bảo vệ, có chiều dài 15 mm,đường kính trong 3,2 mm, cỡ hạt 7µm.
4.4 Cột bảo vệ (tùy chọn), cột Microsorb amino, chiều dài 150 mm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm hoặc tương đương nếu đảm bảo cột phù hợp với hệ thống sắc ký.
4.5 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
4.6 Bể rung siêu âm.
4.7 Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ từ 80 °C đến 85 °C.
4.8 Máy ly tâm, có thể duy trì tốc độ ≥ 2 000 r/min.
4.9 Bình ly tâm, dung tích 100 ml.
4.10 Đũa thủy tinh.
4.11 Màng lọc nylon, cỡ lỗ 0,45 µm.
4.12 Bộ lọc dung môi sắc ký, sử dụng màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm.
5 Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.
Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
6 Cách tiến hành
6.1 Chuẩn bị dung dịch thử
6.1.1 Chiết chất béo
Cân từ 2,00 g đến 10,00 g mẫu thử đã nghiền mịn, cho vào bình ly tâm 100 ml (4.9). Nếu mẫu thử không cần loại chất béo thì thực hiện theo 6.1.2.
Thêm 50 ml ete dầu hỏa (3.3) và ly tâm 10 min với tốc độ 2 000 r/min. Hút và loại bỏ lớp ete dầu hỏa mà không làm thất thoát phần chất rắn. Lặp lại quá trình chiết. Làm bay hơi lượng ete dầu hỏa còn lại dưới dòng khí nitơ và tán nhỏ phần chất rắn bằng đũa thủy tinh (4.10)
6.1.2 Chiết đường
Thêm 100 ml hỗn hợp etanol và nước (tỷ lệ thể tích 1:1) vào các bình ly tâm (4.9) và cân. Đặt các bình ly tâm trong nồi cách thủy (4.7) ở nhiệt độ từ 80 °C đến 85 °C trong 25 min, thỉnh thoảng khuấy. Để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm etanol (3.2) đến lượng cân ban đầu. Lọc dịch chiết qua màng nylon 0,45 µm (4.11). Nếu dung dịch đục thì tiến hành ly tâm 10 min ở tốc độ ≥ 2 000 r/min. Nếu dung dịch vẫn đục, ly tâm lại dịch chiết 5 min ở tốc độ ≥ 3 500 r/min và lọc qua màng nylon 0,45 µm (4.11).
Nếu sử dụng cột bảo vệ thì bỏ qua bước 6.1.3 và tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC theo 6.2.
6.1.3 Làm sạch
Cho đầy pha động vào cột Sep-pak C18 và đẩy qua cột, giữ lại một lớp dung dịch phía trên cột. Lặp lại quá trình này với mẫu thử hai lần, thu dịch dịch lọc lần thứ hai để phân tích LC. Lọc qua màng nylon 0,45 µm (4.11), nếu cần.
6.2 Xác định
6.2.1 Điều kiện vận hành HPLC
Các điều kiện vận hành sau đây được cho là thích hợp:
- Detector: chỉ số khúc xạ (RI);
- Thể tích mẫu bơm: 10 µl đến 50 µl;
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/min đến 2,5 ml/min.
CHÚ THÍCH: Các thông số về thể tích mẫu bơm, tốc độ dòng, nhiệt độ cột có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.
6.2.2 Tiến hành phân tích
Bơm cùng thể tích dung dịch chuẩn (3.6) để thu được tín hiệu trong khoảng ± 10 % so với tín hiệu mẫu. Sau hai lần bơm dung dịch mẫu thì bơm lại một dung dịch chuẩn để đảm bảo độ chụm.
Đo diện tích pic hoặc chiều cao pic của mỗi pic đường trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn, nhưng chỉ đo chiều cao pic đối với các thành phần gần với giới hạn phát hiện và có ảnh hưởng của các pic nhiễu.
6.2.3 Loại trừ ảnh hưởng của các tín hiệu nhiễu do sự có mặt của natri clorua
Chuẩn bị dung dịch trắng natri clorua khoảng 2 mg/ml trong hỗn hợp etanol và nước (tỷ lệ thể tích 1 : 1) và bơm dung dịch trắng ngay sau khi bơm dung dịch chuẩn đường và trước khi bơm dung dịch mẫu.
Nếu natri clorua có ảnh hưởng đến pic của các loại đường đang phân tích thì rửa cột bằng dung dịchTEPA 0,1 % (3.7). Chỉnh pH của dung dịch TEPA đến xấp xỉ 7 bằng dung dịch axit axetic (3.8) sau đó rửa cột trong 2 h với tốc độ 1,5 ml/min và tiếp tục rửa cột với 100 ml pha động trước khi phân tích.
Cách khác, thêm 2 giọt axit axetic đặc (3.8) vào 1 lít dung dịch pha động (3.5) để loại ảnh hưởng của natri clorua trong quá trình rửa giải fructose hoặc glucose.
7 Tính kết quả
Tính hàm lượng mỗi đường trong mẫu thử, Xi, bằng gam trên 100 gam (g/100g), theo Công thức (3):
(3)
Trong đó:
R và R’ tương ứng là diện tích hoặc chiều cao pic của đường trong mẫu thử và trong dung dịch chuẩn;
V là thể tích hỗn hợp etanol và nước để chiết mẫu, tính bằng mililit (V = 100 ml);
W là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
C’ là nồng độ của đường trong dung dịch chuẩn, tính bằng gam trên mililit (g/ml).
8 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
1)Thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.