ISO 17997-1:2004
SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ CASEIN - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)
Milk - Determination of casein-nitrogen content - Part 1: Indirect method (Reference method)
Lời nói đầu
TCVN 12462-1:2018 hoàn toàn tương đương ISO 17997-1:2004;
TCVN 12462-1:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;
Bộ tiêu chuẩn TCVN 12462 (ISO 17997), Sữa - Xác định hàm lượng nitơ casein, gồm các phần sau đây:
- TCVN 12462-1:2018 (ISO 17997-1:2004), Phần 1: Phương pháp gián tiếp (Phương pháp chuẩn);
- TCVN 12462-2:2018 (ISO 17997-2:2004), Phần 2: Phươngpháp trựctiếp.
SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ CASEIN - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)
Milk - Determination of casein-nitrogen content - Part 1: Indirect method (Reference method)
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chuẩn để xác định gián tiếp hàm lượng nitơ casein trong sữa bò.
Phương pháp này có thể được điều chỉnh để áp dụng cho sữa của các động vật khác hoặc sản phẩm sữa dạng lỏng khác.
CHÚ THÍCH: Hàm lượng nitơ casein sẽ giảm theo thời gian bảo quản sữa do casein bị phá vỡ ngay cả khi ở nhiệt độ 4 °C, do đó hàm lượng nito casein của sữa đã bị xử lý nhiệt sẽ cao giả tạo do sự biến tính của whey protein.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 7151:2002 (ISO 648:1977)*), Dụng cụ thínghiệm bằng thủy tinh - Pipet một mức
TCVN 7153:2002 (ISO 1042:1998), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức
TCVN 8099-1 (ISO 8968-1) Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hàm lượng nitơ - Phần 1: Nguyên tắc Kjeldahl và tính protein thô**)
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:
3.1
Hàm lượng nitơ không phải casein (non-casein-nitrogen content)
Phần khối lượng của chất xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.
3.2
Hàm lượng nitơ casein (casein-nitrogen content)
Phần khối lượng của chất xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.
CHÚ THÍCH Cả hai hàm lượng nilơ không phải casein và hàm lượng nitơ casein được biểu thị bằng phần trăm khối lượng.
Hàm lượng nitơ tổng số được xác định bằng phương pháp quy định trong TCVN 8099-1 (ISO 8968-1). Casein được kết tủa từ phần mẫu thử bằng cách thêm dung dịch axit axetic và natri axetat, sao cho pH cuối cùng của hỗn hợp xấp xỉ 4,6. Lọc để tách casein sữa đã kết tủa, sao cho dịch lọc còn lại chỉ chứa các thành phần nitơ không phải casein. Hàm lượng nitơ của phần dịch lọc được xác định theo TCVN 8099-1 (ISO 8968-1). Hàm lượng nitơ casein được tính bằng cách lấy hàm lượng nitơ tổng trừ đi hàm lượng nitơ không phải casein.
Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích hoặc thuốc thử có độ tinh khiết tương đương.
5.1 Thuốc thử để xác định nitơ tổng số
Sử dụng các thuốc thử quy định trong TCVN 8099-1 (ISO 8968-1).
5.2 Dung dịch axit axetic, (CH3CO2H), c = 1,75 mol/l
Dùng pipet định mức (6.6) lấy 10,0 ml axit axetic băng cho vào bình định mức 100 ml (6.3). Pha loãng bằng nước đến vạch.
5.3 Dung dịch natri axetat, (CH3CO2Na), c = 1 mol/l
Hòa tan 8,20 g natri axetat hoặc 13,60 g natri axetat ngậm ba phân tử nước trong bình định mức 100 ml (6.3). Pha loãng bằng nước đến vạch.
Có thể bảo quản dung dịch natri axetat ở nhiệt độ phòng trong một tuần hoặc ở nhiệt độ từ 0 °C đến 4 °C trong 6 tháng.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
6.1 Dụng cụ để xác định nitơ tổng số
Sử dụng các dụng cụ quy định trong TCVN 8099-1 (ISO 8968-1).
6.2 Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ từ 38 °C đến 40 °C.
6.3 Bình định mức một vạch, có nắp đậy, dung tích 100 ml, phù hợp với loại A trong TCVN 7153:2002 (ISO 1042:1998).
6.4 Chai có bộ phân phối phía trên, có thể phân phối 75 ml nước (tùy chọn).
6.5 Ống đong chia vạch, dung tích đến 100 ml.
6.6 Pipet định mức một vạch, dung tích 1 ml, 10 ml và 50 ml, phù hợp với loại A trong TCVN 7151:2002 (ISO 648:1977).
6.7 Phễu lọc, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính 75 mm.
6.8 Giấy lọc, đường kính 15 cm, không chứa nitơ (ví dụ: Whatman No. 11) hoặc tương đương).
Gấp nếp trước khi sử dụng.
6.9 Bình nón hoặc loại tương đương, dung tích 100 ml.
6.10 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
6.11 Pipet tự động hoặc micropipet có thể điều chỉnh được, để phân phối 1,0 ml (tùy chọn).
Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).
Làm ấm mẫu thử trong nồi cách thủy (6.2) ở nhiệt độ từ 38 °C đến 40 °C để làm tan chảy chất béo sữa sao cho có thể lấy ra được phần mẫu sữa đại diện. Trộn nhẹ mẫu ngay trước khi lấy và cân phần mẫu thử (9.1 và 9.2).
9.1 Xác định hàm lượng nitơ tổng số
Xác định hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử (Điều 8),wN, bằng phần trăm khối lượng, theo quy trình sử dụng trong TCVN 8099-1 (ISO 8968-1).
9.2 Xác định nitơ không phải casein
9.2.1 Phần mẫu thử
9.2.1.1 Cân khoảng 10 g phần mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 8), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức (6.3) dung tích 100 ml. Thêm ngay 75 ml nước đã được làm ấm đến 38 °C, sử dụng chai có bộ phận phân phối phía trên (6.4) hoặc dùng ống đong chia vạch (6.5).
Các phần mẫu thử bổ sung có thể được cân và thêm nước ở thời điểm này. Tuy nhiên, phải chú ý để kết thúc bước 9.2.1.2 trong vòng 30 min sau khi cho phần mẫu thử vào bình định mức.
CHÚ THÍCH 30 min là thời gian giới hạn để giảm sự phân giải protein của casein xuống mức tối thiểu trong khi chuẩn bị mẫu.
9.2.1.2 Sử dụng bộ pipet định mức (6.6), pipet tự động hoặc micropipet có điều chỉnh được (6.11), thêm 1 ml dung dịch axit axetic (5.2) vào bình. Đậy nắp bình và xoay bình để trộn. Để bình trong nồi cách thủy (6.2) ở nhiệt độ từ 38 °C đến 40 °C trong 10 min.
Sử dụng một pipet định mức (6.6) khác hoặc pipet tự động hoặc micropipet có thể điều chỉnh được (6.11), thêm 1 ml dung dịch natri axetat (5.3) vào bình, xoay để trộn. Làm nguội lượng chứa trong bình đến 20 °C. Pha loãng bằng nước đến vạch ở 20 °C. Đậy nắp bình và đảo chiều để trộn.
Để yên cho kết tủa lắng xuống. Rót lượng chứa trong bình qua phễu lọc (6.7) có chứa giấy lọc gấp nếp (6.8). Thu lấy toàn bộ dịch lọc vào bình nón 100 ml (6.9). Dịch lọc phải trong và không có chất dạng hạt. Nếu không, lập lại quy trình bắt đầu từ 9.2.1 với phần mẫu thử mới.
CHÚ THÍCH: Phương pháp này sử dụng việc bổ sung thể tích cố định của axit axetic và dung dịch natri axetat đối với từng mẫu. Điều này sẽ không đạt được chính xác pH 4.6 cho từng mẫu sữa. Tuy nhiên, thực tế cho thấy phương pháp thường được sử dụng để phân tích sữa bò, đặc biệt khi cần phân tích số lượng lớn các mẫu. pH dao động trong dải từ 4.5 đến 5,0 cho thấy ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả cuối cùng (xem [8]). Ngoài ra theo dõi pH bằng cách bổ sung axit kết hợp với điều chỉnh nhiệt độ thích hợp để hiệu chuẩn máy đo pH. Trong trường hợp này, độ pha loãng chính xác của từng phần mẫu thử cần được đo và có thể cần tính đến hệ số pha loãng khác đối với từng phần mẫu thử được phân tích.
9.2.1.3 Xoay bình để đảm bảo dịch lọc được trộn đều. Dùng pipet định mức (6.6) cho 50 ml dịch lọc vào bình Kjeldahl hoặc ống phân hủy có chứa hạt trợ sôi, dung dịch kali sulfat và đồng sulfat như quy định trong TCVN 8099-1 (ISO 8968-1).
9.2.1.4 Thêm một lượng thích hợp axit sulfuric vào bình Kjeldahl hoặc ống phân hủy. Phân hủy, chưng cất và chuẩn độ theo TCVN 8099-1 (ISO 8968-1). Khi sử dụng TCVN 8099-1 (ISO 8968-1) chú ý làm nóng từ từ để tránh tạo bọt mạng. Tổng thời gian phân hủy có thể kéo dài hơn thời gian xác định hàm lượng nitơ tổng số.
Bình cầu hoặc ống có thể đậy nắp sau khi thêm axit sulfuric. Quá trình phân hủy, chưng cất và chuẩn độ có thể được thực hiện sau. Ghi lại thể tích chất chuẩn độ và thể tích dung dịch chuẩn axit clohydric nêu trong TCVN 8099-1 (ISO 8968-1) đã dùng, chính xác đến 0,05 ml.
9.3 Phép thử mẫu trắng
Thực hiện phép thử mẫu trắng đồng thời với phép xác định theo cùng một quy trình như trong 9.1 và 9.2.1.2 đến 9.2.1.4 nhưng không có phần mẫu thử.
10.1 Tính kết quả
10.1.1 Hàm lượng nitơ không phải casein
Tính kết quả hàm lượng nitơ không phải casein của mẫu, wNCN, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng theo Công thức sau:
Trong đó:
Vs là thể tích axit clohydric đã dùng trong phép xác định (9.2.1.4), tính bằng mililit (ml);
Vb là thể tích axit clohydric đã dùng trong phép thử mẫu trắng (9.3), tính bằng mililit (ml);
Mlànồng độ mol của dung dịch chuẩn axit clohyric đã dùng theo TCVN 8099-1 (ISO 8968-1);
m là khối lượng phần mẫu thử (9.2.1.1), tính bằng gam (g);
0,994 là hệ số nhân với giả định là sữa có chứa khoảng 3,7 % chất béo và 2,6 % casein [do đó, f = 1 - [(0,11 x 0,037) + (0,007 x 0,026)] = 0,994 (xem chú thích).
CHÚ THÍCH: Có thể cần điều chỉnh hệ số nhân nếu các sản phẩm sữa được phân tích có dạng lỏng có thành phần khác nhau đáng kể hoặc sữa của các loài động vật được phân tích như sau (xem Tài liệu tham khảo [6]):
f = 1 - [(0,11 x % chất béo/100) + (0,07 x % casein/100)]
10.1.2 Hàm lượng protein không phải casein
Tính hàm lượng protein không phải casein của mẫu, wNCP, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng theo Công thức sau:
wNCP = wNCNx 6,38
Trong đó 6,38 là hệ số nhân được dùng để chuyển đổi hàm lượng nitơ của sản phẩm sữa sang hàm lượng protein.
10.1.3 Hàm lượng nitơ casein
Tính hàm lượng nitơ casein của mẫu, wCN, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng theo Công thức sau:
wCN= wN- wNCN
Trong đó wN là hàm lượng nitơ của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng.
10.1.4 Hàm lượng casein
Tính kết quả hàm lượng casein trong mẫu thử, wC, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng theo Công thức sau:
wC = wCNx 6,38
Trong đó 6,38 là hệ số nhân được dùng để chuyển đổi hàm lượng nitơ của sản phẩm sữa sang protein.
10.2 Biểu thị kết quả
Biểu thị các kết quả đến ba chữ số sau dấu phẩy nếu cần để tính tiếp. Đối với kết quả cuối cùng, biểu thị kết quả thu được về hàm lượng nitơ đến ba chữ số sau dấu phẩy và hàm lượng casein đến hai chữ số sau dấu phẩy. Không làm tròn kết quả cho đến khi tính kết quả cuối cùng.
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các giá trị thử riêng rẽ từ phép phân tích nhiều mẫu được dùng để tính thống kê hiệu năng của phương pháp và dao động giữa các phòng thử nghiệm. Một ví dụ khác là khi các giá trị được sử dụng là chuẩn để hiệu chuẩn thiết bị (ví dụ: máy phân tích sữa bằng hồng ngoại) trong đó các giá trị từ nhiều mẫu sẽ được dùng trong việc tính đơn giản hoặc hồi quy đa biến.
11.1 Các phép thử liên phòng thử nghiệm
Các giá trị giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập thu được từ kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 57252).
Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này được nêu trong Tài liệu tham khảo [5]. Các giá trị này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các giá trị đã nêu.
11.2 Độ lặp lại
11.2.1 Nitơ không phải casein
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị tính theo khối lượng dưới đây:
- phần khối lượng nitơ:0,004 % hoặc
- phần khối lượng casein:0,03 %
11.2.2 Nitơ casein
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị tính theo khối lượng dưới đây:
- phần khối lượng nitơ:0,006 % hoặc
- phần khối lượng casein:0,04 %
11.3 Độ tái lập
11.3.1 Nitơ không phải casein
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do những người phân tích khác nhau thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị tính theo khối lượng dưới đây:
- phần khối lượng nitơ:0,007 % hoặc
- phần khối lượng casein:0,05 %
11.3.2 Nitơ casein
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do những người phân tích khác nhau thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị tính theo khối lượng dưới đây:
- đối với phần khối lượng nitơ:0,010 % hoặc
-đối với phần khối lượng casein:0,06 %
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;
e) kết quả thử nghiệm thu được và nếu thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.
[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Các định nghĩa và nguyên tắc chung.
[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản để xác định độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp đo tiêu chuẩn.
[4] TCVN 12462-2 (ISO 17997-2), Sữa - Xác định hàm lượng nitơ casein - Phần 2: Phương pháp trực tiếp
[5] AOAC INTERNATIONAL Compendium of Methods, 16th ed. (1999 revision), methods 998.05 - 998.07
[6] LYNCH, J.M., BARBANO, D.M. and FLEMING, J.R. J. Assoc. Off. Anal. Chem. International, 81,1998 pp. 763-774
[7] ROWLAND, S.J. J. Dairy Res., 9,1938, pp. 42-46
[8] ROWLAND, S.J. J. Dairy Res., 9,1938, pp. 30-41
*) Hiện nay đã thay thế bằng TCVN 7151:2010 (ISO 648:2008), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet một mức
**) TCVN 8099-1:2009 (ISO 8968-1:2001), TCVN 8099-2:2009 (ISO 8968-2:2001) đã được thay thế bằng TCVN 8099-1:2015 (ISO 8968-1:2014).
1) Whatman No.1 là ví dụ về sản phẩm thương mại thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương.
2) ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard testmethodby inter-laboratory tests (hiện nay đã hủy), được sử dụng để thu dữ liệu về độ chụm.