Fish and fishery products - Determination of mercury (methyl) content by liquid chromatographic - atomic absorption spectrophotometric method
Lời nói đầu
TCVN 12347:2018 được xây dựng dựa trên cơ sở tham khảo AOAC 990.04 Mercury (Methyl) in Seafood Liquid Chromatographic. Atomic Absorption Spectrophotometric Method;
TCVN 12347:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METYL THỦY NGÂN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG - QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ
Fish and fishery products - Determination of mercury (methyl) content by liquid chromatographic - atomic absorption spectrophotometric method
CẢNH BÁO Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng metyl thủy ngân trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng - quang phổ hấp thụ nguyên tử (LC - AAS).
Dịch rửa giải sắc ký lỏng (LC) được gia nhiệt để tạo ra hơi thủy ngân (Hg) từ các hợp chất thủy ngân hữu cơ. Hơi thủy ngân cùng với pha động đã hóa hơi, được đưa trực tiếp vào bình ngưng làm mát bằng nước, tại đó pha động hóa lỏng. Thủy ngân được hơi nitơ mang vào cuvet hấp thụ đường quang của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước sử dụng là nước cất hai lần bằng thiết bị thủy tinh, trừ khi có quy định khác.
3.1 Dung dịch natri thiosulfat, 0,01 M.
Hòa tan 2,5 g natri thiosulfat ngậm năm phân tử nước (Na2S2O3.5H2O) và pha loãng bằng nước đến 1 lít.
3.2 Dung dịch axit clohydric, 1,8 M
Pha loãng 148 ml axit clohydric đậm đặc đến 1 lít.
3.3 Celite 545, đã rửa bằng axit.
3.4 Dung dịch chuẩn metyl thủy ngân clorua
3.4.1 Dung dịch chuẩn gốc, nồng độ thủy ngân 100 µg/ml.
Cân 0,125 g metyl thủy ngân clorua (CH3HgCl) cho vào bình định mức 1 lít. Thêm 20 ml metanol, lắc để hòa tan metyl thủy ngân clorua, pha loãng dung dịch bằng nước đến vạch và trộn.
3.4.2 Dung dịch chuẩn làm việc, nồng độ thủy ngân 0,050,0,100,0,150,0,200 và 0,250 µg Hg/100µl
Thêm tương ứng các thể tích 20,40,60,80 và 100 µl dung dịch chuẩn gốc CH3HgCl(3.4.1) vào 20 ml CHCl3 trong từng ống đong chia vạch dung tích 25 ml có nút thủy tinh.
Dùng pipet thêm 4,0 ml dung dịch natri thiosulfat (3.1), lắc nhẹ hỗn hợp 1 min và để yên 5 min. Sử dụng pipet dùng một lần, chuyển phần nổi phía trên có chứa phức methyl-thủy ngân-thiosulfat cùng với nhũ tương vào bình nón 25 ml. Thổi mạnh khí nitơ vào bình trong khoảng 1 min đến 2 min để phân tách nhũ tương và loại bỏ các giọt CHCl3.
3.5 Dung dịch amoni axetat, 0,05 M
Hòa tan 3,9 g amoni axetat và pha loãng bằng nước đến 1 lít.
3.6 Pha động, hỗn hợp metanol-ammoni axetat 0,05 M (tỉ lệ 3:2) (phần thể tích)
Trộn 3 thể tích metanol với 2 thể tích dung dịch amoni axetat và chỉnh pH đến 5,7 ± 0,2 bằng axit acetic băng. Loại khí bằng heli(He). Thêm 0,1 ml 2-mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng. Lắc nhẹ để trộn đều, cẩn thận để càng ít không khí lẫn vào dung dịch càng tốt.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
CHÚ THÍCH Rửa sạch tất cả dụng cụ thủy tinh bằng chất tẩy rửa (ví dụ: Micro Laboratory Cleaner, Sản phẩm Quốc tế, Trenton, NJ 08601 hoặc tương đương) và tráng kỹ bằng nước nóng, sau đó bằng nước cất hoặc nước đã khử ion. Tráng bằng axeton và để khô.
4.1 Thiết bị LC/AAS, được trang bị các bộ phận sau đây, xem Hình 1.
CHÚ DẪN
1 Đĩa gia nhiệt 2 Máy đo lưu lượng 3 Máy đo nhiệt | 4 Bình ngưng ngắn 5 Nắp cao su 6 Ống thép không gỉ | 7 Ống xi phông 8 Bình đun sôi 9 Ống thép không gỉ | 10 và 11 Ống nhựa 12 Dây nối điện đến thiết bị chuyển điện áp |
Hình 1- Thiết bị LC/AAS
4.1.1 Bộ gia nhiệt
Đĩa gia nhiệt, ví dụ loại: HSP, 120 V, 200 W, đường kính ngoài 3,25 in, chiều dày 11/32 in, bằng magie và nhôm cách nhiệt, dày 1 in.
4.1.2 Máy đo lưu lượng
4.1.3 Dụng cụ đo nhiệt độ, dụng cụ đo nhiệt độ cao, cặp nhiệt điện.
4.1.4 Bộ ngưng tụ, chiều dài vỏ bọc 175 mm, nút ống chuẩn 24/40.
4.1.5 Nắp cao su, số 5, cao su tổng hợp.
4.1.6 Ống thép không gỉ, đường kính ngoài 1,6 mm, đường kính trong 1 mm.
4.1.7 Ống nghiệm, 125 mm x 15 mm.
4.1.8 Bình đun sôi, 2 cổ, dung tích 500 ml.
4.1.9 Ống thép không gỉ, chiều dài 15 cm.
4.1.10 Ống nhựa, loại cách điện, đường kính trong 1,45 mm đến 1,7 mm.
4.1.11 Ống nhựa, loại cách điện, kết nối với hệ thống AAS.
4.1.12 Bộ chuyển đổi điện áp, phích cắm chuẩn.
4.2 Bơm LC, ví dụ Tracor 950 hoặc loại tương đương, với đầu phun vòng cố định 100 µl.
4.3 Cột LC, ví dụ Zorbax ODS, 5 µm, 4,6 mm x 25 cm.
4.4 Cột bảo vệ, chiều dài 7 cm xđường kính trong 2,1 mm, được nhồi CO:Pell ODS cỡ hạt 25 µm đến 37 µm.
4.5 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử
Được trang bị đèn catốt rỗng Hg, bộ hiệu chỉnh nền deuteri và cuvet thạch anh đường kính trong 10 mm đến 25 mm, chiều dài 100 mm đến 115 mm, có dòng khí lưu thông qua bình với các đầu mở hoặc đầu kín. Làm theo các hướng dẫn vận hành của nhà sản xuất đề xác định Hg bằng cách sử dụng bước sóng 253,7 nm và bộ hiệu chỉnh nền deuteri. Đáp ứng điển hình khi bơm chuẩn làm việc 0,100 µg Hg/100 µl là khoảng 0,20 A, sử dụng cuvet đường kính trong 25 mm x 115 mm. Sử dụng thiết bị ghi để đạt đủ mức 30 % đến 50 % thang đo khi bơm 0,100 µg Hg/100 µl chuẩn. Dải làm việc từ 0,01 đến 0,25 µg Hg/100 µl đã bơm.
4.6 Cột sắc ký thủy tinh, đường kính ngoài 25 mm, đường kính trong 22 mm, chiều dài 250 mm.
4.7 Máy đồng hóa, ví dụ Polytron (số 10/35) với đầu PTA-10S (USA) hoặc tương đương.
4.8 Bộ điều chỉnh biến áp, hoạt động trong dải từ 0 V đến 140 V.
4.9 Ống thép không rỉ, đường kính trong 0,25 mm.
4.10 Que nhồi, dài 8 cm.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
6.1 Cài đặt thiết bị
Các thành phần của thiết bị LC/AAS (xem Hình 1) được đặt bên trong hộp có hiển thị kích thước. Hộp có cửa thủy tinh hữu cơ ở phía trước, phía sau và phía trên có thể tháo ra được. Các chi tiết từ 1 đến 3 được gắn chốt vào các cạnh của hộp. Cài đặt các bộ phận còn lại như sau: ống thép không gỉ (4.1.6) dài 30 inch để tăng thêm bề mặt gia nhiệt. Đặt phần uốn cong, cùng với bộ phận cặp nhiệt điện, giữa 2 đĩa gia nhiệt, được giữ chặt bằng vít ở giữa đĩa trên. Lắp bộ gia nhiệt vào thùng cách nhiệt bằng hợp kim magie - nhôm dày 25 mm và bảo đảm an toàn cho tấm nhôm bằng các vỏ bọc bằng nhôm và vít.
Đẩy ống thép không rỉ từ ống tháo bộ gia nhiệt qua tâm nút cao su (4.1.5) sao cho phần cuối ống đặt gần bình ngưng khi nút được chèn chặt vào đầu của bộ ngưng tụ (4.1.4). Đẩy thêm 2 ống thép không rỉ dài 15 cm (4.1.9) qua nút cao su để làm cửa hút nitơ và đầu ra hơi thủy ngân. Kết nối các ống với máy đo lưu lượng (4.1.2) với ống nghiệm bẫy bằng các ống cách nhiệt. Kết nối bình Nitơ với máy đo lưu lượng bằng ống cách nhiệt và các phụ kiên Swagelok và khớp nối chuẩn.
Kết nối đầu ra từ cột LC với ống thép không rỉ đường kính trong 0,25 mm (4.9), được nối với đầu vào của ống gia nhiệt bằng các phụ kiện Swagelok chuẩn 1,6 mm và khớp nối có thể tích chết bằng không.
Kết nối đầu ra của ống nghiệm bẫy (ống nhựa, 4.1.11) vào cuvet của thiết bị AAS bằng nút cao su nhỏ (4.1.5) chèn vào cạnh của cuvet.
6.2 Chuẩn bị mẫu thử
Chỉ sử dụng phần ăn được của mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản. Đồng hóa mẫu thử trong máy xay. Có thể thêm nước để đồng hóa, nhưng phải được đưa vào công thức cuối cùng. Cân 10,00 g ± 0,30 g phần mẫu thử (dạng ướt) đã đồng nhất vào cốc có mỏ 100 ml. Chuẩn bị dung dịch thử bằng cách thêm dung dịch axit clohydric (3.2) sao cho khối lượng phần mẫu thử cộng với dung dịch HCl là 25,00 g ± 0,30 g. Trộn dung dịch phân tích trong máy đồng hóa (4.7) khoảng 1 min để thu được huyền phù.
Cân ngay 10,00 g dung dịch đồng nhất vào cốc có mỏ chứa 10 g Celite 545 (3.3) và trộn đều. Dùng thìa chuyển định lượng hỗn hợp vào cột sắc ký (4.6), chứa một miếng gạc bằng bông thủy tinh ở phía dưới. Ép hỗn hợp bằng que nhồi dài khoảng 8 cm (4.10) và đặt miếng gạc bằng bông thủy tinh lên trên.
Rửa giải cột bằng 20 ml triclo metan bằng cách thêm bốn lần mỗi lần 5 ml. Thu 20 ml dịch rửa giải lần đầu vào xylanh chia độ 25 ml có nắp đậy.
Dùng pipet thêm 4,0 ml dung dịch natri thiosulfat (3.1), lắc nhẹ hỗn hợp 1 min và để yên 5 min. Sử dụng pipet dùng một lần, chuyển phần nổi phía trên có chứa phức methyl-thủy ngân-thiosulfat cùng với nhũ tương vào bình nón 25 ml. Thổi mạnh khí nitơ vào bình trong khoảng 1 min đến 2 min để phân tách nhũ tương và loại bỏ các giọt triclo metan.
CHÚ THÍCH 1 Để phân tách nhũ tương, giữ và xoay bình ở góc 45° và dòng nitơ tiếp xúc trực tiếp với lớp mỏng của nhũ tương dính ở đáy bình khi xoay.
CHÚTHÍCH 2 Một số loài hải sản có thể tạo chất chiết gây đục. Khi đó, trong trường hợp này cần được lọc qua màng lọc.
6.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng thuốc thử
Chuẩn bị dung dịch phân tích thuốc thử trắng bằng cách cân 25,00 g dung dịch HCl(3.2) cho vào các có mỏ dung tích 100 ml.
Cân ngay 10,00 g dung dịch đồng nhất vào cốc có mỏ chứa 10 g Celite 545 (3.3) và trộn đều. Dùng thìa chuyển định lượng hỗn hợp vào cột sắc ký (4.6), chứa một miếng gạc bằng bông thủy tinh ở phía dưới. Ép hỗn hợp bằng que nhồi dài khoảng 8 cm (4.10) và đặt miếng gạc bằng bông thủy tinh lên trên.
Rửa giải cột bằng 20 ml triclo metan bằng cách thêm bốn lần mỗi lần 5 ml. Thu 20 ml dịch rửa giải lần đầu vào xylanh chia độ 25 ml có nắp đậy.
Dùng pipet thêm 4,0 ml dung dịch natri thiosulfat (3.1), lắc nhẹ hỗn hợp 1 min và để yên 5 min. Sử dụng pipet dùng một lần, chuyển phần nổi phía trên có chứa phức methyl-thủy ngân-thiosulfat cùng với nhũ tương vào bình nón 25 ml. Thổi mạnh dòng khí nitơ vào bình trong khoảng 1 min đến 2 min để phân tách nhũ tương và loại bỏ các giọt triclo metan.
6.4 Điều kiện vận hành thiết bị LC/AAS
6.4.1 Bật hệ thống
a) điều chỉnh tốc độ dòng chảy pha động đến 0,7 ml/min.
b) đưa nước vào bình ngưng.
c) điều chỉnh dòng nitơ đến 0,1 l/min (áp suất bình chứa khí là 1,04 kPa) và cài đặt 10,0 l/min (trên máy đo lưu lượng).
d) điều chỉnh từ từ nhiệt độ của bộ gia nhiệt đến 550 °C.
e) sau khi nhiệt độ đạt đến 550 °C, kiểm tra tính ổn định của hệ thống bằng cách bơm lượng dung dịch chuẩn metyl thủy ngân. Thời gian lưu metyl thủy ngân là 5 min đến 6 min. Độ chụm giữa chiều cao pic methyl thủy ngân ≤ 5 %. Bơm tất cả các dung dịch chuẩn để kiểm tra độ tuyến tính. Nếu không đạt được những thông số này thì kiểm tra rò rỉ hoặc thay ống rửa giải sau khi sử dụng lâu dài.
CHÚ THÍCH Để kiểm tra thiết bị có thể sử dụng một bộ chuẩn khác cùng nồng độ với chuẩn phân tích bằng cách pha loãng trực tiếp dung dịch chuẩn gốc (3.4.1) với dung dịch Na2S2O3 0,01 M. Chỉ sử dụng các chuẩn này để kiểm tra thiết bị. Để chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ thủy ngân 0,05,0,100,0,150,0,200 và 0,250 µg/100 µl, pha loãng các thể tích 1,1,3,2, và 5 ml dung dịch chuẩn 100 µg Hg/ml (3.4.1) với dung dịch Na2S2O3 0,01 N tương ứng đến 200,100,200,100 và 200 ml.
6.4.2 Tắt hệ thống
1) Tắt bộ gia nhiệt và để nguội đến gần nhiệt độ phòng.
2) Tắt các linh kiện khác, nhưng không tắt dòng chảy pha động trong khi bộ gia nhiệt nóng thì cacbon có thể lắng đọng và làm tắc ống rửa giải. Do đó không bơm các dung môi hữu cơ nguyên chất, như metanol, để làm sạch cột trong khi bộ gia nhiệt còn nóng.
3) Sau khi bộ gia nhiệt nguội đến nhiệt độ phòng, bơm metanol vào để rửa cột.
6.5 Phép xác định
Bơm 100 µl dung dịch mẫu thử đã chuẩn bị trong 6.2 (0,100 g được bơm đối với 10,0 g phần mẫu thử) vào hệ thống LC/AAS. Sau khi xuất hiện pic thủy ngân metyl, bơm 100 µl dung dịch chuẩn để tạo ra chiều cao pic ngang bằng hoặc cao hơn một chút so với chiều cao pic của dung dịch mẫu thử. Lặp lại bằng cách bơm dung dịch thử và tiếp theo chuẩn đã chọn. Nếu chiều cao pic dung dịch mẫu thử cao hơn chiều cao pic của chuẩn cao nhất, thì pha loãng dung dịch mẫu thử (không nhỏ hơn 1,00 ml, sử dụng pipet piston dịch chuyển dương) với dung dịch Na2S2O3 (3.1). Tính hệ số pha loãng trong công thức cuối cùng.
Đo chiều cao pic trên đường nền và tính nồng độ metyl thủy ngân bằng cách so sánh chiều cao pic trung bình của dung dịch mẫu với chiều cao pic trung bình của dung dịch chuẩn.
Tính nồng độ thủy ngân gắn vào methyl trong mẫu, X, biểu thị theo microgam thủy ngân trên gam, (µg/g), tính theo Công thức (1):
(1)
trong đó:
R là chiều cao pic trung bình của dung dịch thử (A);
R' là chiều cao pic trung bình của dung dịch chuẩn (A);
W' là lượng chuẩn đã bơm, tính bằng microgam thủy ngân (µg Hg);
W là lượng mẫu thử đã bơm, tính bằng gam (g)
(2)
Trong đó:
D là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
E là khối lượng dung dịch phân tích, tính bằng gam (g);
F là khối lượng dung dịch thêm vào cốc chứa Celite, tính bằng gam (g);
0,100 là thể tích dung dịch mẫu thử được bơm vào hệ thống LC/AAS, tính bằng mililit (ml).
Nếu pha loãng mẫu, cần bổ sung hệ số pha loãng vào công thức tính.
Nếu cần, hiệu chỉnh A đối với dung dịch thử để A tương ứng với dung dịch mẫu trắng pha loãng (6.3). Giới hạn định lượng là 0,006 µg Hg/100µl đã bơm, được định nghĩa là 10 lần độ lệch chuẩn của mẫu trắng thuốc thử. Giới hạn này tương ứng với giới hạn định lượng 0,06 µg Hg/g đối với phần mẫu thử 10 g.
Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:
- mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu;
- phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
- phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
- kết quả thử nghiệm thu được.