THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AURAMINE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)
Foodstuffs - Determination ofauramine - Liquid chromatography with tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method
Lời nói đầu
TCVN 12267:2018 do Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 1 - Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và thủy sản biên soạn. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AURAMINE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)
Foodstuffs - Determination ofauramine - Liquid chromatography with tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method
CẢNH BÁO - khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị về các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng auramine trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS).
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 3,0 µg/kg trên mẫu thịt và 5.0 µg/kg trên nền mẫu măng chua, bánh nhân thủy sản và thức ăn chăn nuôi.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
Hàm lượng auramine trong mẫu dược chiết bằng axetonitril, dịch chiết sau ly tâm được lọc qua màng lọc kích thước lỗ 0,22 µm và được phân tích bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS).
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước được sử dụng là nước loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3606), trừ khi có quy định khác.
4.1 Axatonitril (CH3CN).
4.2 Axit axetic (CH3COOH) (≥ 99,85 %)
4.3 Chuẩn auramine (C17H21N3), độ tinh khiết lớn hơn hoặc bằng 95 %.
4.4 Metanol (CH3OH).
4.6 Amoni axetat (CH3COONH4).
4.6 Nước cất (H2O).
4.7 Dung dịch amoni axetat 1 M
Lấy 19,27 g amoni axetat (4.5) cho vào bình định mức 250 ml (5.15) và thêm nước cất (4,6) đến vạch. Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu ở nhiệt độ phòng, dung dịch này ổn định trong 1 tháng.
4.8 Pha động A dung dịch amoni axetat 0,005 M
Lấy 5 ml dung dịch amoni axetat 1 M (4.7) vào cốc 1000 ml thêm nước đến 900 ml điều chỉnh pH đến 3 bằng axit axetic (4.2), chuyển toàn bộ vào bình định mức 1000 ml (5.15), thêm nước đến vạch. Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu ở nhiệt độ phòng, dung dịch này ổn định trong 1 tuần.
4.9 Pha động B, metanol (4.4).
4.10 Dung dịch chuẩn auramine gốc 1000 mg/l
Lấy 10 mg chuẩn auramine (4.3) vào bình định mức 10 ml (5.15). Thêm khoảng 8 ml axetonitril (4.1) lắc đều, thêm axetonitril đến vạch. Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.17) ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng -18 °C, dung dịch ổn định trong 6 tháng.
CHÚ THÍCH: Tùy thuộc vào lượng cân, độ tinh khiết của chuẩn auramine, tính toán lại nồng độ chuẩn thực tế.
4.11 Dung dịch chuẩn auramlno trung gian 100 mg/l
Lấy chính xác 1 ml chuẩn auramine gốc 1000 mg/l (4.10) vào bình định mức 10 ml, thêm axetonitril (4.1) đến vạch. Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.17) ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng -18°C, dung dịch ổn định trong 3 tháng.
4.12 Dung dịch chuẩn auramine trung gian 10 mg/l
Lấy 1 ml dung dịch chuẩn auramine trung gian 100 mg/l (4.11) cho vào bình định mức 10 ml (5.15), thêm axetonitril (4.1) đến vạch. Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.17) ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng -18 °C, dung dịch ổn định trong 1 tháng.
4.13 Dung dịch chuẩn auramine trung gian 1 mg/l
Lấy 1 ml dung dịch chuẩn auramine trung gian 10 mg/l (4.12) cho vào bình định mức 10 ml (5.15), thêm axetonitril-(4.1) đến vạch. Bảo quản trong chai thủy tinh tối màu 15 ml (5.17) ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng 4 °C, dung dịch ổn định trong 1 tuần.
4.14 Dung dịch chuẩn làm việc
Pha chuẩn auramine ở các nồng độ 0,0; 3,0; 5,0; 10,0; 30,0 µg/l cụ thể như sau:
Lấy 5 bình định mức 10 ml (5.15) ký hiệu S1, S2, S3, S4, S5;
Thêm lần lượt 0; 30; 50; 100; 300 µl dung dịch chuẩn auramine 1 mg/l (4.13) vào lần lượt các bình;
Dựng chuẩn trong dung môi (đốivới mẫu thịt): định mức tới vạch bằng axetonitril (4.1).
Dựng chuẩn trên nền mẫu (các nền mẫu thực phẩm khác): định mức tới vạch bằng dung dịch chiết mẫu trắng (7.2.2).
Chuẩn làm việc được chuẩn bị trước mỗi đợt phân tích.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:
5.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS
- Bơm 2 kênh dung môi biến đổi dòng;
- Đầu dò MS-MS;
- Máy tính và phần mềm phân tích;
- Cột sắc ký pha đảoC18, dài 100 mm, đường kính trong 2,1 mm, kích thước hạt nhồi 1,8 µm.
5.2 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg.
5.3 Cân kĩ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.
5.4 Tủ lạnh đông, hoạt động liên tục ở nhiệt độ ≤ -18 °C.
5.5 Máy ly tâm, tốcđộtối thiểu 6000 r/min, ly tâm được ống 15 ml và 50 ml.
5.6 Bể siêu âm, tần số lớn hơn hoặc bằng 25kHZ, công suất tối thiểu 200W.
5.7 Máy xay mẫu;
5.8 Bộ lọc dung môi bằng thủy tinh;
5.9 Máy lắc mẫu, tốcđộtối thiểu 2500 r/min;
5.10 Ống ly tâm nhựa, dung tích 15 ml; 50 ml có nắp;
5.11 Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml có nắp và đệm PTFE;
5.12 Đầu tip, dung tích 100; 200; 1000 và 5000 µl;
5.13 Micropipet, dung tích 100; 200; 1000 và 5000 µl;
5.14 Bộ lấy dung môi tự động, thể tích 25 ml,điều chỉnh được;
5.15 Bình định mức bằng thủy tinh, dung tích 10; 100; 250 và 1000 ml;
5.16 Cốc thủy tinh, dung tích 250; 500 và 1000 ml;
5.17 Chai thủy tinh tối màu, dung tích 15; 250; 500 và 1000 ml;
5.18 Chai nhựa tối màu, dung tích 250 ml;
5.19 Màng lọc dung môi, đường kính 45 mm, kích thước lỗ 0,22 µm bằng PTFE;
5.20 Đầu lọc mẫu, đường kính 13 mm, kích thước lỗ 0,22 µm, làm bằng PTFE;
5.21 Xylanh, dung tích 1 ml;
5.22 Túi đựng mẫu bằng chất dẻo
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong quá trình vận chuyển, bảo quản.
Toàn bộ quy trình phân tích cần được thực hiện trong ngày.
7.2.1 Chuẩn bị mẫu thử
Với mẫu đông lạnh, trước khi đồng nhất phải được rã đông: Chuyển mẫu từ tủ đông để rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 min hoặc giữ nguyên bao gói kín xả dưới vòi nước trong 10 min tới khi mẫu mềm có thể cắt được.
Lấy ít nhất 250 g mẫu, dòng hóa mẫu bằng máy xay mẫu (5.7). Chuyển mẫu đã đồng nhất sang túi đựng mẫu bằng chất dẻo (5.22), gập miệng túi (ghim lại nếu cần) lưu trữ ở nhiệt độ phòng đối với mẫu khô, lưu trữ ở nhiệt độ ≤ -18 °C đối với mẫu tươi hoặc mẫu đông lạnh. Khi thực hiện phân tích, phải đưa mẫu về nhiệt độ phòng.
Cân (2,00 g ± 0,05 g mẫu đãđồng nhất vào ống ly tâm nhựa 50 ml (5.10).
7.2.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu không có auramine.
Cân (2.00 ± 0,05) g mẫu trắng đã đồng nhất vào ống ly tâm nhựa 50 ml (5.10). Mẫu trắng được tiến hành như mẫu thử. Thực hiện tối thiểu một mẫu trắng trong một lô mẫu.
7.2.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát nồng độ 30 µg/kg
Cân (2,00 ± 0,05) g mẫu trắng đã đồng nhất vào ống ly tâm nhựa 50 ml (5.10), thêm 60 µl dung dịch chuẩn auramine 1 mg/l (4.13), trộn đều bằng máy lắc mẫu (5.9) ở tốc độ 2500 r/min trong 2 min. Thực hiện tối thiểu một mẫu kiểm soát trong một lô mẫu.
Độ thu hồi của mẫu kiểm soát tham khảo Phụ lục A.
7.3.1 Chiết mẫu
Cho 10 ml axetonitril (4.1) vào mỗi ống, đậy nắp;
Lắc ngay bằng máy lắc mẫu (5.9) ở tốc độ 2500 r/min trong 2 min.
Siêu âm bằng bể siêu âm (5.6) trong 10 min;
Ly tâm 6000 r/min, trong 10 min;
7.3.2 Xử lý dịch chiết
Hút hết dung dịch lớp trên cho vào ống 50 ml (5.10).
Thêm 10 ml axetonitril vào các ống chứa mẫu, Lắc 2 min trên mây lắc mẫu (5.9), siêu âm bằng bể siêu âm (5.6) trong 10 min;
Ly tâm 6000 r/min, trong 10 min;
Hút hết dung dịch lớp trên cho vào ống 50 ml (5.10).
Trộnđều dung dịch thu được; lọc dịch thu được qua màng lọc 0,22 µm (5.16) vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (5.11), đậy kín nắp đem phân tích trên LC-MS/MS,
7.4 Điều kiện phân tích của LC-MSMS
7.4.1 Yêu cầu chung
Đảm bảo các pic sắc ký có dạng phân bố Gauss, thời gian lưu (tR) của các chất phải bằng hoặc lớn hơn hai lần thể tích chết của cột. Mỗi chất phân tích thu được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con. không có pic nhiễu tại vị trí của píc phân tích.
7.4.2 Điều kiện phân tích trận LC (tham khảo Phụ lục 6)
7.4.3 Điều kiện phân tích trên đầu dò MSMS (tham khảo Phụ lục C)
7.4.4 Thời gian lưu và các phân mảnh ion (tham khảo Phụ lục D)
7.4.5 Trình tự bơm mẫu
Dung môi (pha động); các dung dịch chuẩn; mẫu trắng; mẫu kiểm soát; mẫu thử. Sau 10 mẫu phải bơm lại một điểm chuẩn hoặc mẫu kiểm soát (7.2.3).
Đường chuẩn được xây dựng dưới dạng y = ax + b (1)
Trong đó:
y: là diện tích pic của chất chuẩn tương ứng;
x: là nồng độ của chất chuẩn tương ứng;
a: là hệ số gốc của đường chuẩn;
Giá trị bộ số chặn (b) nên gần giá trị0 và hệ sốhồi quy tuyến tính (r2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.
Độ lặp lại kết quả của điểm chuẩn hoặc mẫu kiểm soát phải nhỏ hơn hoặc bằng 21%; Nếu kết quả lặp lại vượt quá 21% thì phải bơm lại đường chuẩn; kết quả các mẫu sau tính toán dựa trên đường chuẩn mới.
8.1 Hàm lượng auramine trong mẫu thử
Hàm lượng auramine X, biểu thị bằng microgam trên kilogam (µg/kg), được tính theo công thức (2):
(2)
Trong đó:
X0, là nồng độ auramine trong dung dịch mẫu thử đưa vào LC-MSMS, được xác định theo đường chuẩn (1), tính bằng microgam trên kilogam (µg/l);
V là thể tích axetonitril chiết mẫu (ml);
m là khối lượng mẫu phân tích (gam);
F là hệ số pha loãng mẫu.
CHÚ THÍCH: khi hàm lượng auramine trong mẫu thử vượt quáđường chuẩn, mẫu được pha loãng bằng dung dịch axetonitril (4.1) đối với mẫu thịt hoặc dung dịch chiết mẫu (7.2.1) đối với mẫu khác.
Kết quả thử nghiệm được báo cáo với một chữ số thập phân, đơn vị tính làµg/kg.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- Kết quả thử nghiệm;
- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- Phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- Tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả.
Kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm
A.1 Hệ số hồi quy tuyến tính (r2) của đường chuẩn
Hệ số hồi quy tuyến tính (r2) của đường chuẩn phải≥ 0,99.
A.2 Độ thu hồi của mẫu kiểm soát
Độ thu hồi của mẫu kiểm soát phải nằm trong khoảng quy định trong Bảng A.1
Bảng A.1 - Quy định về độ thu hồi
Nồng độ | Độ thu hồi (%) |
0,1 % | 95-105 |
100 ppm | 90-107 |
10ppm | 80-110 |
1 ppm | 80-110 |
100 ppb | 80-110 |
10 ppb | 60-115 |
1 ppb | 40-120 |
A.3 Độ lệch cường độ ion tương đối:
Độ lệch cường độ ion tương đối phải nằm trong giới hạn theo Bảng A.2
Bảng A.2 - Giới hạn tối đa độ lệch cường độ ion tương đối
Cường độ ion tương đối | Độ lệch cho phép |
>50% | ±20% |
> 20 % đến 50 % | ±25% |
> 10 % đến 20% | ±30% |
≤ 10% | ±50% |
Thiết bị LC: | HPLC hai kênh dung môi, có thể chạy gradient, có thể đạt áp suất tối đa 1034 bar. |
Cột phân tích: | cột sắc ký pha đảo C18, dài 100 mm, đường kính trong 2,1 mm, kích thước hạt nhồi 1,8 µm; |
Nhiệt độ cột: | 40 °C; |
Thể tích bơm mẫu: | 14 µl; |
Pha động: | gradient hai kênh như Bảng 3. |
Kênh A: | dung dịch amoni axetat 0,005 M pH 3 (4.6); |
Kênh B: | metanol (4.4). |
Bảng B.1 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC
Thời gian, min | Tốc độ dòng, (ml/min) | Kênh A, % | Kênh B, % |
0 | 0,2 | 90 | 10 |
2 | 0,2 | 90 | 10 |
6 | 0,2 | 10 | 90 |
7 | 0,2 | 1 | 99 |
7,5 | 0,2 | 90 | 10 |
Điều kiện phân tích trên đầu dò MS/MS
- Chế độ ion hóa: ion hóa phun điện tử ESI, chế độ ion dương (ESI+)
- Nhiệt độ nguồn ion hóa: 350 °C.
- Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 350 °C.
- Tốc độ khí mang: 8 L/min
- Áp suất phun: 2,76 bar.
- Chế độ quét: MRM, theo các điều kiện như Bảng C.1.
Bảng C.1 .Điều kiện phân mảnh MS-MS
Thành phần | lon sơ cấp (m/z) | lon thứ cấp (m/z) | Framentor | Coll (eV) |
Auramine | 268.3 | 252,1 147,1 | 110 | 25 25 |
Thời gian lưu và phân mảnh ion
Bảng D.1 - Ví dụ về thời gian lưu và phân mảnh ion
Chất phân tích | Ion sơ cấp (m/z) | lon thứ cấp(m/z) | Thời gian lưu (min) |
Auramine | 268,3 | 252,1 147,1 | 6,66 |
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] Quy trình phân tích “Xác định dư hàm lượng auramine bảng sắc ký lồng ghép khối phổ (LC-MSMS)” của Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 1.
[2] Journal of Chromatography B, 879(2011)2416- 2422.
[3] Determination of synthetic dyes in bean and meat products by liquid chromatography with tandem mass spectrometry, 2014 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.