Foodstuffs dietary supplements and raw botanical materials - Determination of aristolochic acid I - Liquid chromatographic method with UV detection (LC-UV) and confirmation by LC/MS
Lời nói đầu
TCVN 11940:2017 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2007.05 Aristolochic acid I in botanicals and dietary supplements potentially contaminated with aristolochic acid I - LC-UV with confirmation by LC/MS;
TCVN 11940:2017 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F6 Dinh dưỡng và thức ăn kiêng biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỰC PHẨM BỔ SUNG VÀ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH AXIT ARISTOLOCHIC-1 - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG VỚI DETECTOR UV (LC-UV) VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG SẮC KÝ LỎNG PHỔ KHỐI LƯỢNG
Foodstuffs dietary supplements and raw botanical materials - Determination of aristolochic acid I - Liquid chromatographic method with UV detection (LC-UV) and confirmation by LC/MS
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định axit aristolochic-1 trong thực phẩm bổ sung và nguyên liệu thực vật bằng sắc ký lỏng với detector UV (LC-UV) và khẳng định bằng sắc kí lỏng-phổ khối lượng.
Axit aristolochic-1 được chiết bằng axetonitril ra khỏi các nền mẫu khác nhau. Lượng axit aristolochic-1 được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng (LC) sử dụng detector độ hấp thụ UV và khẳng định bằng sắc kí lỏng-phổ khối lượng (LC/MS).
Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước đã khử ion hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.
3.1 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
CẢNH BÁO: Axetonitril là dung môi dễ cháy; cần tránh xa nguồn nhiệt hoặc ngọn lửa và có thông gió phù hợp.
3.2 Axit trifluoraxetic, có độ tinh khiết 99,8 %.
CẢNH BÁO: Axit trifluoroacetic là chất ăn mòn, chất kích thích dạng lỏng, có thể gây bỏng nặng.
3.3 Etanol, 100 % (thể tích), loại dùng cho đo phổ/HPLC.
3.4 Metanol, loại dùng cho HPLC.
3.5 Axit formic, 88 %.
3.6 Amoni axetat, loại dùng cho HPLC.
CHÚ THÍCH Các thuốc thử chất lượng tương đương có thể được sử dụng.
3.7 Chất chuẩn axit aristolochic-1, cũng được gọi là axit aristolochic A, có độ tinh khiết ≥ 94 %.
CẢNH BÁO: Axit aristolochic-1 là chất độc, chất kích thích dạng rắn.
3.8 Thuốc thử dùng cho sắc ký
3.8.1 Pha động A đối với HPLC-UV, 0,1 % dung dịch axit trifluoroaxetic (thể tích) trong nước.
3.8.2 Pha động B đối với HPLC-UV, 0,1 % dung dịch axit trifluoroaxetic (thể tích) trong axetonitril.
3.8.3 Dung môi chiết, hỗn hợp của axetonitril - nước (thể tích 50 + 50).
3.8.4 Pha động A cho sắc ký lỏng khối phổ đầu dò 3 tứ cực, hỗn hợp của metanol 5 %, axit formic 0,1 % và amoni axetat 10 mM trong nước.
3.8.5 Pha động B cho sắc ký lỏng khối phổ đầu dò 3 tứ cực, hỗn hợp của axetonitril-metanol (1 + 1) chứa axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 10 mM trong nước.
3.8.6 Pha động A cho sắc ký lỏng khối phổ bẫy ion, hỗn hợp của axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong nước đã khử ion.
3.8.7 Pha động B cho sắc ký lỏng khối phổ bẫy ion, hỗn hợp của axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong metanol.
3.9 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
3.9.1 Dung dịch chuẩn gốc, khoảng 200 µg/ml
Dùng cân (4.1) cân khoảng 0,002 g axit arstolochic-1 (3.7), chính xác đến 0,00001 g và chuyển vào bình định mức dung tích 10 ml (4.12). Hòa tan axit aristolochic-1 (3.7) và pha loãng bằng axetonitril (3.1) đến vạch. Nồng độ dung dịch chuẩn gốc, C0, biểu thị bằng microgam trên mililit (µg/ml), tính bằng Công thức (1):
(1)
Trong đó:
m là khối lượng của axit aristolochic-1, tính bằng gam (g);
v0 là dung tích bình định mức, tính bằng mililit (ở đây v0 = 10 ml);
P là độ tinh khiết của axit aristolochic-1;
106 là hệ số chuyển đổi từ gam sang microgam.
Để khẳng định lại nồng độ chuẩn, tiêm dung dịch chuẩn gốc đã chuẩn bị vào hệ thống HPLC (4.8) để thu được phần tinh khiết, sau đó lấy 1 ml pha loãng bằng etanol (3.3) đến 5 ml và đọc độ hấp thụ trên máy quang phổ (4.7) ở bước sóng 390 nm. Nồng độ đúng của chất chuẩn, biểu thị bằng microgam trên mililit (µg/ml), được tính bằng Công thức (2):
(2)
Trong đó:
A1 là độ hấp thụ đo được ở bước sóng 390 nm;
6500 là hệ số tắt phân tử đối với axit aristolochic-1 (nồng độ tính theo g.mol/l);
341,29 là khối lượng mol của axit aristolochic-1, tính bằng gam trên mol (g/mol);
f là độ tinh khiết của dung dịch chuẩn gốc sau khi qua hệ thống HPLC;
5 là độ pha loãng (từ 1 ml thành 5 ml).
Dung dịch ổn định trong vòng 30 ngày khi được bảo quản tránh ánh sáng và trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.
LƯU Ý: Nồng độ được khẳng định lại trước khi pha các chuẩn làm việc.
3.9.2 Dung dịch chuẩn làm việc
Pha loãng các dung dịch chuẩn ở 6 mức nồng độ từ khoảng 0,040 µg/ml đến 0,64 µg/ml trong hỗn hợp axetonitril - nước (50 + 50) theo Bảng 1. Các dung dịch này bền trong 14 ngày khi bảo quản tránh ánh sáng và trong tủ lạnh duy trì ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.
Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc
| Chuẩn | Nồng độ gốc | Thể tích dung dịch gốc sử dụng | Thể tích cuối cùng | Nồng độ |
| Dung dịch chuẩn gốc làm việc | 200 | 0,800 | 10 | 16,0 |
| 1 | 16,0 | 0,0625 | 25 | 0,0400 |
| 2 | 16,0 | 0,190 | 25 | 0,122 |
| 3 | 16,0 | 0,250 | 25 | 0,160 |
| 4 | 16,0 | 0,500 | 25 | 0,320 |
| 5 | 16,0 | 0,750 | 25 | 0,480 |
| 6 | 16,0 | 1,00 | 25 | 0,640 |
3.9.3 Đánh giá sự phù hợp của hệ thống
Sau khi chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn làm việc, hiệu năng của hệ thống HPLC (4.8) được xác định như sau: Tiêm dung dịch chuẩn làm việc khoảng 0,320 µg/ml ít nhất 5 lần liên tục. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của đáp ứng ở ít nhất 5 lần tiêm không quá 2 %. Ngoài ra, tiêm dung dịch chuẩn làm việc khoảng 0,0400 µg/ml ít nhất 3 lần và tính tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N). Tỷ số tín hiệu trên nhiễu phải >10. Thời gian lưu của axit aristolochic-1 trong khoảng 21 min ± 3 min. Tốc độ dòng chảy có thể được điều chỉnh để đạt được thời gian lưu mong muốn.
Các điều kiện HPLC có thể cần được thay đổi để có được hệ thống phù hợp mong muốn.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,00001 g.
4.2 Máy nghiền loại nhỏ, loại dùng để nghiền cafe hoặc gia vị.
4.3 Máy lắc.
4.4 Cột sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
4.4.1 Với đầu dò UV, ví dụ Zorbax SB-C18, 5 µm, kích thước 25 cm x đường kính trong 3,0 mm.
4.4.2 Với đầu dò sắc kí lỏng khối phổ bẫy ion, ví dụ Zorbax SB-C18, 5 µm, kích thước 15 cm x đường kính trong 3,0 mm.
4.4.3 Với sắc kí lỏng khối phổ đầu dò 3 tứ cực, ví dụ Zorbax SB-C18, 5 µm, kích thước 5 cm x đường kính trong 2.1 mm.
4.5 Sàng, cỡ lỗ 400 µm.
4.6 Hệ thống sắc kí lỏng khối phổ, bẫy ion hoặc ba tứ cực
4.7 Máy quang phổ tử ngoại-khả kiến (UV-VIS), đo độ hấp thụ ở bước sóng 390 nm.
4.8 Hệ thống HPLC, có trang bị detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS).
4.9 Bộ lọc xyranh, 13 mm với màng lọc PTFE cỡ lỗ 0,45 µm.
4.10 Hệ thống dữ liệu cho HPLC.
4.11 Hệ thống dữ liệu cho sắc ký lỏng phổ khối lượng.
4.12 Bình định mức, dung tích 10 ml.
CHÚ THÍCH Các thiết bị tương đương có thể được sử dụng. Tất cả các dụng cụ thủy tinh phải phù hợp loại A[1].
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể nào liên quan đến sản phẩm cần phân tích thì các bên tự thảo thuận về vấn đề này.
Cho vật liệu nghiền qua sàng cỡ lỗ 400 µm (4.5), nếu cần và trộn kỹ. Cân khoảng 2 g mẫu thử cho vào bình có nắp đậy. Thêm 100 ml dung môi chiết (3.1). Lắc tối thiểu 30 min trên máy lắc (4.3) đặt ở chế độ lắc cố định. Pha loãng dung dịch thử với dung môi chiết cho thích hợp với đường chuẩn, nếu cần. Dung dịch thử có thể được bảo quản lạnh không quá 2 ngày. Lọc dung dịch thử bằng bộ lọc xyranh có màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm (4.9) rồi tiến hành phân tích HPLC và định lượng. Sử dụng các thông số nêu trong Bảng 2. Tiêm từng dung dịch chuẩn làm việc (3.9.2), một bộ ở thời điểm bắt đầu và một bộ ở thời điểm kết thúc chạy. Tiêm dung dịch chuẩn sau mỗi 4 dung dịch thử, bắt đầu ở mức thấp nhất, tiếp đến 4 dung dịch thử tiếp theo, sau đó là dung dịch chuẩn cao nhất v.v... Sử dụng tất cả các giá trị đo được của dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn.
Bảng 2 - Thông số HPLC-UV
| Cột HPLC | Zorbax SB-C18, 5 µm, đường kính 3,0 mm x 25 cm, Agilent | ||
| Pha động A | 0,1% (thể tích) axit trifluoroacetic - nước | ||
| Pha động B | 0,1% (thể tích) axit trifluoroacetic - axetonitril | ||
| Chương trình tiêm | |||
| Thời gian, min | % A | % B | Đường gradient |
| 0 | 80 | 20 | Không áp dụng |
| 25 | 30 | 70 | 1b |
| 30 | 0 | 100 | 1 |
| 31 | 80 | 20 | 1 |
| 40 | 80 | 20 | Không áp dụng |
| Detector | detector hấp thụ UV (bước sóng 390 nm) |
| |
| Nhiệt độ cột, °C | 40 |
| |
| Tốc độ dòng | Khoảng 0.5 ml/min; tốc độ dòng phải điều chỉnh được sao cho có thể thu được thời gian lưu mong muốn |
| |
| Thể tích tiêm, µl | 25 |
| |
| Thời gian tiêm, min | 40 |
| |
| b đường gradient cho thấy sự chuyển đổi tuyến tính. | |||
7 Khẳng định bằng sắc kí lỏng khối phổ
Khi xác định bằng LC-UV, axit aristolochic-1 xác định được ở nồng độ > 2 µg/g, được khẳng định bằng LC/MS/MS. Phổ của chất chuẩn được sử dụng để khẳng định sự có mặt của axit aristolochic-1 so với phổ của mẫu ở thời gian lưu tương tự. Mỗi diện tích pic được phát hiện của chuẩn hoặc mẫu với các ion con được chia bằng diện tích pic của một ion con với diện tích pic lớn nhất. Nếu nhiều mẫu và chuẩn được tiêm vào thì tính trung bình tất cả các tỷ lệ tương ứng. Để khẳng định, tỷ lệ mẫu nên bằng ± 10 % tỷ lệ chuẩn trung bình (chênh lệch số học). Ví dụ, tỷ lệ trung bình của chuẩn là 50 %, thì tỷ lệ mẫu là từ 40 % đến 60 %.
Các điều kiện sắc kí và ion hóa được kiểm soát đối với ba tứ cực nêu trong Bảng 3 và đối với bẫy ion nêu trong Bảng 4.
Bảng 3 - Các điều kiện sắc ký đối với sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực
| Cột HPLC | Zorbax SB-C18, 5 µm, đường kính 2,1 mm x 50 mm, Agilent | ||||
| Pha động A | Metanol 5,0 %, axit formic 0,1 %, và amoni axetat 10 mM trong nước đã khử ion | ||||
| Pha động B | Axetonitril-metanol (1+1) chứa axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 10 mM trong nước đã khử ion | ||||
| Chương trình tiêm | |||||
| Thời gian, min | A % | B % | Gradient | ||
| 0 | 70 | 30 | Không áp dụng | ||
| 13 | 30 | 70 | 1b | ||
| 15 | 0 | 100 | 1 | ||
| 16 | 70 | 30 | 1 | ||
| 20 | 70 | 30 | Không áp dụng | ||
| Nhiệt độ cột, °C | 40 |
| |||
| Tốc độ dòng, ml/min | 0.2 |
| |||
| Thể tích tiêm, µl | 25 |
| |||
| Đưa mẫu | Phun điện tử dương (ES+) |
| |||
| Chế độ | |||||
| Dải khối lượng | Quét các ion con đặc trưng, dwell = 0,25 s |
| |||
| Nhiệt độ nguồn, °C | 150 |
| |||
| Nhiệt độ hóa hơi, °C | 350 |
| |||
| Tốc độ khí hóa hơi, l/h | 600 |
| |||
| Lưu lượng khí cone, l/h | 60 |
| |||
| Các ion được kiểm soát trong phép khẳng định khối phổ LC/MS | |||||
| Hợp chất | Ion mẹ (m/z) | Ion con (m/z) | Cone, V | Năng lượng bắn phá, eV | |
| [axit aristolochic-1 + NH4]+ | 359,1 | 265, 281, 296 | 18 | 40, 40, 30 | |
Bảng 4 - Các điều kiện sắc ký đối với sắc ký lỏng khối phổ bẫy ion
| Cột HPLC | Zorbax SB-C18, đường kính 3 mm x 150 mm, Agilent | ||||
| Pha động A | axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong nước đã khử ion | ||||
| Pha động B | axit formic 0,1 % (thể tích) và amoni axetat 0,1 % (khối lượng/thể tích) trong metanol | ||||
| Chương trình tiêm | |||||
| Thời gian, min | % A | % B | gradient | ||
| 0 | 80 | 20 | Không áp dụng | ||
| 20 | 0 | 100 | 1b | ||
| 21 | 80 | 20 | 1 | ||
| 25 | 80 | 20 | Không áp dụng | ||
| Nhiệt độ cột, °C | 40 |
|
| ||
| Tốc độ dòng, mL/min | 0.5 |
|
| ||
| Thể tích tiêm, µL | 30 |
|
| ||
| Đưa mẫu | Bẫy ion |
|
| ||
| Chế độ | |||||
| Scan dải nồng độ | m/z 80 to 370 |
|
| ||
| Dòng phóng điện, µA | 5 |
|
| ||
| Nhiệt độ mao quản đã gia nhiệt, °C | 150 |
|
| ||
| Nhiệt độ hóa hơi, °C | 450 |
|
| ||
| Cài đặt khí bay hơi | 70 |
|
| ||
| Cài đặt khí bổ trợ | 20 |
|
| ||
| Các ion được kiểm soát trong phép khẳng định khối phổ bẫy ion | |||||
| Hợp chất | Ion mẹ (m/z) | Ion | Độ rộng phân tách (m/z) | Năng lượng va chạm tương đối, % | |
| Axit aristolochic-1 | 359 | 298 | 2 | 30 | |
| Axit aristolochic-1 | 298,0 (từ ion con ở trên) | 251, 252, 268 | 2 | 35 | |
Đường chuẩn thu được từ hồi quy tuyến tính của tất cả diện tích pic và nồng độ của chuẩn làm việc. Hệ số tương đối (r) phải ≥ 0,99500. Xác định nồng độ axit aristolochic-1 của mẫu đã tiêm từ phân tích hồi quy.
Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử, X, được tính bằng microgam trên gam (µg/g), theo Công thức (3):
(3)
Trong đó:
C là nồng độ chất phân tích từ đường hồi quy, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);
V là thể tích dung môi chiết, tính bằng mililit (ml);
D là hệ số pha loãng, nếu có;
W là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).
Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau:
- mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu;
- phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
- phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
(tham khảo)
Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với axit aristolochic-1
Bảng A.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với axit aristolochic-1
| Tên mẫu | Trung bình, µg/g | Sra | RSDrb, % | Src | RSDrd, % | Số PTN ngoại lệ | Chỉ số HorRat | Số PTN sử dụng |
| Aristolochia manschuriensis, thân | 2610 | 44,9 | 1,72 | 222 | 8,51 | 2 | 1,7 | 8 |
| Clematis armandii, thân | 6,94 | 0,654 | 9,42 | 0,850 | 12,3 | 1 | 1,0 | 9 |
| Viên nén bổ sung liều cao, rễ Aristolochia spp. 20 µg/g | 12,8 | 2,08 | 16,3 | 2,53 | 19,8 | 0 | 1,8 | 10 |
| Aristolochia spp., rễ | 1290 | 23,8 | 1,85 | 69,7 | 5,42 | 0 | 1,0 | 10 |
| Clematis armandii, thân, bổ sung liều thấp Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ | 206 | 0,754 | 7,31 | 0,875 | 8,48 | 0 | 0,8 | 10 |
| Stephania tetrandra, rễ, bổ sung liều thấp Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ | 10,0 | 1,18 | 11,8 | 1,82 | 18,2 | 0 | 1,6 | 10 |
| Akebia trifoliata, thân, bổ sung ít Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ | 7,83 | 0,518 | 6,61 | 0,807 | 10,3 | 0 | 0,9 | 10 |
| Viên nén bổ sung liều thấp Aristolochia spp. 10 µg/g, rễ | 6,58 | 0,875 | 13,3 | 0,875 | 13,3 | 2 | 1,1 | 8 |
| Stephania tetrandra, rễ, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ | 16,7 | 0,844 | 5,04 | 1,16 | 6,92 | 3 | 0,7 | 7 |
| Akebia trifoliata, thân, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ | 15,0 | 0,790 | 5,25 | 2,05 | 13,7 | 0 | 1,3 | 10 |
| Clematis armandii, thân, bổ sung liều cao Aristolochia spp. 20 µg/g, rễ | 20,5 | 0,849 | 4,14 | 1,68 | 8,18 | 0 | 0,8 | 10 |
| Akebia trifoliata, thân |
| NAe | NA | NA | NA | 1 | NA | 9 |
| Stephania tetrandra, rễ |
| NA | NA | NA | NA | 0 | NA | 10 |
| a Sr là độ lệch chuẩn lặp lại. b RSDr là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại. c SR là độ lệch chuẩn tái lập. d RSDR độ lệch chuẩn tương đối tái lập. e NA là không áp dụng. | ||||||||
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức.