MẬT ONG - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG AMITRAZ BẢNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ
Honey - Determination ofamitraz residues by gas chromatography mass spectrometry
Lời nói đầu
TCVN 11837:2017 do Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
MẬT ONG - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG AMITRAZ BẢNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ
Honey - Determination ofamitraz residues by gas chromatography mass spectrometry
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng amitraz có trong mật ong gồm amitraz ở thể gốc và amitraz ở dạng chuyển hóa thành 2,4 dimethylaniline bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ.
Giới hạn định lượng của phương pháp là 25 µg/kg.
Dư lượng amitraz và chất chuyển hóa của amitraz có trong mật ong được thủy phân trong môi trường axit để tạo thành 2,4 dimethylaniline. Tiếp theo, dung dịch mẫu được chuyển sang môi trường kiềm và được chiết bằng iso-octan. Sau đó, một phần dịch chiết được lọc, tạo dẫn xuất bằng heptafluorobutyric anhydride (HFBA) và đưa vào phân tích bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) để xác định và định lượng amitraz có trong mẫu.
Trong tiêu chuẩn này, chỉ sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích.
3.1 Iso-octan.
3.2 Axetonitril.
3.3 Axit clohydric đậm đặc (HCI).
3.4 Natri hiđroxit (NaOH).
3.5 Natri bicabonat (NaHCO3).
3.6 Heptafluorobutyric anhydrit (HFBA).
3.7 Nước cất 2 lần khử ion.
3.8 Dung dịch NaOH 50 %: Hòa tan 100 g NaOH (3.4) trong 100 ml nước (3.7). Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 12 tháng.
3.9 Dung dịch HFBA 10 %: Hòa tan 1 ml HFBA (3.6) trong 9 ml iso-octan (3.1). Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 12 tháng.
3.10 Dung dịch NaHCO3 bão hòa: Hòa tan 300 g NaHCO3 (3.5) trong 500 ml nước (3.7) đựng trong cốc đong 1 lít (4.16). Vừa khuấy vừa đun nhẹ trên bếp khuấy từ gia nhiệt (4.7) và thêm từ từ NaHCO3 (3.5) vào tới khi dung dịch không thể hòa tan được nữa. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 12 tháng.
3.11 Khí nitơ, độ tinh khiết 99,9%.
3.12 Khí Heli, độ tinh khiết 99,999%.
3.13 Chất chuẩn amitraz, độ tinh khiết 99,0 %.
3.14 Chất chuẩn 2,4 dimethylaniline (2,4 DMA), độ tinh khiết 98 %.
3.15 Chất nội chuẩn 2,6 dimethylaniline (2,6 DMA), độ tinh khiết 99 %.
3.16 Dung dịch chuẩn gốc amitraz, 2,4 DMA và 2,6 DMA, 2000 µg/ml
3.17 Dung dịch chuẩn gốc amitraz, 2000 µg/ml
Cân 100 mg chất chuẩn amitraz chính xác đến ± 0,1 mg (3.13) vào bình định mức dung tích 50 ml(4.10). Hòa tan và định mức đến vạch bằng axetonitril (3.2).
3.18 Dung dịch chuẩn gốc 2,4 DMA, 2000 µg/ml
Cân 100 mg chất chuẩn 2,4 DMA chính xác đến ± 0,1 mg (3.14) vào bình định mức dung tích 50 ml (4.10). Hòa tan và định mứcđếnvạchbằng iso-octan (3.1).
3.19 Dung dịch chuẩn gốc 2,6 DMA, 2000 µg/ml
Cân 100 mg chất chuẩn 2,6 DMA chính xác đến ±0,1 mg (3.15) vào bình định mức dung tích 50 ml(4.10). Hòa tan và định mức đến vạch bằng iso-octan (3.1).
LƯU Ý: Lượng cân được điều chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C, trong 1 năm.
3.20 Dung dịch chuẩn trung gian amitraz, 10 µg/ml
Hút chính xác 250 µl dung dịch chuẩn gốc amitraz 2000 µg/ml (3.17) cho vào bình định mức 50 ml (4.10) Hòa tan và định mức tới vạch bằng axetonitril (3.2).
3.21 Dung dịch chuẩn trung gian 2,4 DMA, 10 µg/ml
Hút chính xác 250 µl dung dịch chuẩn gốc 2,4 DMA 2000 µg/ml (3.18) cho vào bình định mức 50 ml (4.10) Hòa tan và định mức tới vạch bằng iso-octan (3.1).
3.22 Dung dịch chuẩn trung gian 2,6 DMA, 10 µg/ml
Hút chính xác 250 µl dung dịch chuẩn gốc 2,6 DMA 2000 µg/ml (3.19) cho vào bình định mức 50 ml (4.10) Hòa tan và định mức tới vạch bằng iso-octan (3.1).
LƯU Ý: Dung dịch chuẩn trung gian được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C, trong 3 tháng.
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Hệ thống sắc ký khí khối phổ GC-MS; bao gồm thiết bị GC, thiết bị MS, bộ phận bơm mẫu tự động, cột sắc ký DB - 5MS (Nhiệt độ tối đa của cột 325 °C; thông số cột: 30 m x 250 µm x 0,25 µm). Máy tính và phần mềm phân tích.
4.2 Cân phân tích, có độ chính xác đến ± 0,01 mg.
4.3 Máy lắc ngang, tốc độ 300 r/min.
4.4 Máy votex, 400 r/min.
4.5 Bộ bay hơi nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ.
4.6 Bể điều nhiệt, có điều chỉnh nhiệt độ
4.7 Bếp khuấy từ gia nhiệt, có điều chỉnh nhiệt độ và tốc độ khuấy;
4.8 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 r/min.
4.9 Micropipet, dung tích 100 µl, 1000 µl, 5000 µl.
4.10 Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml.
4.11 Bình chuẩn bị mẫu, dung tích 500 ml.
4.12 Lọ đựng mẫu GC, dung tích 1,5 ml, có nắp đệm PTFE.
4.13 Ống ly tâm polypropylen, có nắp, dung tích 15 ml.
4.14 Đầu lọc, kích thước lỗ 0,2 µm, PTFE.
4.15 Giấy lọc, kích thước lỗ 0,45 µm.
4.16 Cốc đong, dung tích 1 I.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này nhưng mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
6.1 Đồng nhất mẫu thử
Đồng nhất mẫu: Trộn đều bằng máy lắc ngang (4.3) để đồng nhất mẫu trước khi tiến hành phân tích. Cân 10,0 g (± 0,1 g) mẫu đã đồng nhất vào bình chuẩn bị mẫu (4.11).
6.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử (6.1).
Mẫu trắng là mẫu mật ong đã được xác định không nhiễm amitraz (amitraz ở thể gốc và chất chuyển hóa 2,4 DMA).
6.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng (6.2) nhưng sau khi cân mẫu, bổ sung 100 µl dung dịch chuẩn amitraz có nồng độ 10 µg/ml (3.20) vào mẫu. Trộn đều bằng máy vortex (4.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
6.4 Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn
Mẫu xây dựng đường chuẩn được chuẩn bị từ mẫu trắng (6.2) nhưng sau khi cân mẫu, bổ sung dung dịch chuẩn amitraz có nồng độ 10 µg/ml (3.20) để được các điểm chuẩn như Bảng 1. Trộn đều bằng máy vortex (4.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
Bảng 1 - Dung dịch để dựng đường chuẩn
Chuẩn tương đương trên mẫu (ng/ml) | C1= 0 | C2 = 100 | C3 = 200 | C4 = 400 | C5 = 800 |
Thể tích amitraz 10 µg/ml thêm vào (µl) | 0 | 100 | 200 | 400 | 800 |
6.4.1 Tính hệ số tín hiệu
Tính cho chất cần phân tích theo phương trình:
RF= | Sp |
SpIS |
Trong đó: RF: hệ số tín hiệu của chất phân tích trên chất nội chuẩn;
Sp: diện tích pic của chất cần phân tích;
SpIS: diện tích pic của chất nội chuẩn.
6.4.2 Xây dựng đường chuẩn
Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu và chuẩn bị mẫu theo mục 6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b. Trong đó:
RF: hệ số tín hiệu của chất phân tích trên chất nội chuẩn;
x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu;
b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;
a: hệ số góc của đường chuẩn.
7.1 Chiết mẫu và làm sạch mẫu
7.1.1 Chiết mẫu:
Cân 10,0 g ± 0,1 g mẫu đã đồng nhất vào bình chuẩn bị mẫu (4.11). Cho 2,0 ml axit HCI đậm đặc (3.3) và 60 ml nước khử ion (3.7) vào từng bình mẫu. Đậy nắp và trộn đều trên bếp khuấy từ gia nhiệt (4.7) trong 1 min;
Tiếp theo, đưa các bình mẫu vào bể điều nhiệt (4.6) ở nhiệt độ 90 °C trong 3,5 h;
Sau đó, lấy mẫu ra, đưa mẫu về nhiệt độ phòng. Tiếp theo, cho từ từ 5 ml NaOH 50 % (3.8) vào mỗi mẫu, vừa cho NaOH 50 % vào mẫu vừa trộn đều trên bếp khuấy từ gia nhiệt (4.7).
7.1.2 Làm sạch mẫu:
Thêm vào mỗi mẫu 80 ml iso-octan (3.1), trộn đều bằng máy vortex (4.4) trong 1 min;
Hút 10 ml lớp iso-octan phía trên, lọc qua giấy lọc (4.15) cho vào ống ly tâm 15 ml (4.13). Ly tâm mẫu bằng máy ly tâm (4.8) ở tốc độ 4000 r/min, thời gian 5 min, nhiệt độ 4 °C.
Hút 8 ml lớp trên cho vào ống ly tâm (4.13).
7.1.3 Thêm chất nội chuẩn vào mẫu:
Cho 50 µl dung dịch nội chuẩn 2,6 DMA 10 µg/ml trong iso-octan (3.1) vào mỗi mẫu.
7.1.4 Tạo dẫn xuất:
Cho 100 µl dung dịch HFBA 10 % (3.9) vào mỗi mẫu và các dung dịch điểm chuẩn, trộn đều bằng máy vortex (4.4). Để yên mẫu thử 30 min ở nhiệt độ phòng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex (4.4);
Mẫu được bay hơi bằng bộ bay hơi nitơ (4.5) ở nhiệt độ 40 °C đến khi thể tích còn khoảng 0,5 ml;
Định mức mẫu bằng 1 ml iso-octan và trộn đều bằng máy vortex (4.4);
Tiếp theo, thêm 1,5 ml dung dịch NaHCO3 bão hòa (3.10) vào mẫu, trộn đều bằng máy vortex (4.4). Mẫu được để yên trong 30 min ở nhiệt độ phòng, sau đó hút lớp trên, lọc qua đầu lọc 0,2 µm (4.14) đưa vào lọ đụng mẫu GC (4.12);
Tiến hành phân tích trên hệ thống GC-MS (4.1).
7.2 Tiến hành phân tích trên GC-MS
Các điều kiện chung cho toàn hệ thống phân tích GC-MS: tối ưu hóa các thông số hoạt động của hệ thống sắc ký khí khối phổ (GC-MS) trong phân tích dư lượng amitraz (xác định độ đặc hiệu của thiết bị đối với amitraz). Thực hiện chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký khí như chương trình nhiệt độ, thể tích bơm mẫu, tốc độ dòng khí, nhiệt độ buồng chuyển tiếp, nhiệt độ ionsource, thời gian tắt/mở bộ phận tạo điện tử...để chất phân tích thu được tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu nền (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mành ion và luôn tồn tại 1 ion định lượng, 2 ion định tính; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.
7.2.1 Điều kiện GC
Bơm mẫu:
Chế độ rửa và bơm tự động (dung dịch rửa axeton) thực hiện trước bơm mẫu 3 lần và sau bơm mẫu 3 lần, rửa bằng mẫu 3 lần, bơm 2 µl mẫu thử.
Buồng bơm mẫu:
Nhiệt độ: 250 °C;
Áp suất: 9,4 psi;
Tốc độ dòng: 1 ml/min;
Chế độ: không chia dòng.
Chế độ lò:
Nhiệt độ: 80 °C;
Thời gian ổn định: 1 min;
Nhiệt độ tối đa: 310 °C.
Chương trình nhiệt độ cột tách như sau: giữ ở 70°C trong 1,5 min; tăng từ 70°C đến 160°C với tốc độ 10°C/min; tăng từ 160°C đến 280°C với tốc độ tăng 20°C/min và giữ ở 280 °C trong 3,5 min.
7.2.2 Điều kiện trên MS
Nhiệt độ bộ phận kết nối phổ khối lượng: 280 °C;
Chế độ ion hóa: chế độ va chạm điện tử (El);
Nhiệt độ nguồn MS: 230 °C;
Nhiệt độ tứ cực: 150 °C;
Thời gian cắt dung môi: 4 min;
CHÚ THÍCH: Nếu không cắt dung môi sẽ làm bộ phận tạo điện tử (filament) nhanh bị cháy.
Chế độ: chế độ chọn lọc Ion (SIM) theo Bảng 2.
Bảng 2 - Các phân mảnh ion
STT | Tên chất | Ion định lượng (m/z) | Ion định tính 1 (m/z) | Ion định tính 2 (m/z) | Thời gian lưu |
1 | 2,4 DMA | 317 | 148 | 120 | 9,371 |
2 | 2,6 DMA | 317 | 148 | 120 | 9,003 |
7.3 Trình tự bơm mẫu
- Bơm dung môi kiểm tra máy: iso-octan (3.1);
- Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;
- Bơm mẫu trắng;
- Bơm mẫu kiểm soát;
- Bơm mẫu thử.
- Bơm dung môi kiểm tra máy: iso-octan (3.1).
8.1 Tính kết quả
Dư lượng amitraz cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử được tính theo công thức sau:
Trong đó:
C là hàm lượng amitraz có trong mẫu, tính bằng microgam trên kilogam (µg/kg);
Cx là nồng độ amitraz được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lit (µg/l);
V1 là thể tích dung môi iso-octan dùng để chiết mẫu, tính bằng mililit (ml);
V2 là thể tích dịch chiết mẫu được sử dụng để chuyển hóa mẫu, tính bằng mililit (ml);
V3 là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng mililit (ml);
F là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);
m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).
8.2 Biểu thị kết quả
Kết quả được biểu thị bằng đơn vị µg/kg (ppb), đến hai số sau dấu phẩy.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;
- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;
- Kết quả thử nghiệm thu được.
[1] Amitraz in honey. Standard Operating Procedure #M-P061a. JR Laboratories Inc. Version: 1.4. Date issued: 23/2/2007.
[2] Document SANCO/12571/2013, Guidance document on analytical quality control and validation procedures for Pesticide residues analysis in food and feed.
[3] Qui trình nội bộ của Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I