MẬT ONG - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CARBENDAZIM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN
Honey - Determination of carbendazim residues by liquid chromatography tanderm mass spectrometry
Lời nói đầu
TCVN 11835:2017 do Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
MẬT ONG - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CARBENDAZIM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN
Honey - Determination of carbendazim residues by liquid chromatography tanderm mass spectrometry
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng carbendazim trong mật ong bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần.
Giới hạn định lượng của phương pháp là 7,5 µg/kg.
Phương pháp này còn có thể áp dụng để xác định các hợp chất: Carbendazime, thiophanat metyl.
Dư lượng carbendazim trong mật ong được tính bằng tổng dư lượng của carbendazime và thiophanat metyl.
Chất phân tích được tách chiết bằng dung dịch 1 % axit axetic trong axetonitril, dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp QuEChERS. Hàm lượng chất phân tích được xác định bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần LC-MS/MS, sử dụng nội chuẩn carbendazime d3.
Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất 2 lần khử ion.
4.1 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
4.2 Axetonitril, loại dùng cho LC/MS.
4.3 Nước, loại dùng cho LC/MS.
4.4 Axit axetic.
4.5 Axit formic.
4.6 Natri axetat (CH3COONa).
4.7 Magie sulfat (MgSO4).
4.8 Chất chuẩn carbendazime, độ tinh khiết 99,0 %.
4.9 Chất chuẩn thiophanat metyl, độ tinh khiết 98,0 %.
4.10 Nội chuẩn carbendazime d3, độ tinh khiết 99,0 %.
4.11 Dung dịch 1% axit axetic trong axetonitril
Lấy 1 ml axit axetic (4.4) và 99 ml axetonitril (4.1) cho vào lọ thủy tinh có nắp (5.12), lắc đều trong 1 min, sử dụng trong ngày.
4.12 Pha động cho LC-MS/MS
Kênh A: Lấy 100 µl axit formic (4.5) và 1 lít nước dùng cho LC/MS (4.3) cho vào chai đựng dung môi (5.13).
Kênh B: Lấy 100 µl axit formic (4.5) và 1 lít axetonitril dùng cho LC/MS (4.2) cho vào chai đựng dung môi (5.13).
4.13 Dung dịch chuẩn gốc carbendazime, thiophanat metyl, 1000 µg/ml
Cân 50 mg ± 0,1 mg mỗi loại chất chuẩn vào mỗi bình định mức dung tích 50 ml (5.9) riêng biệt. Hòa tan và định mức tới vạch bằng axetonitril (4.2). Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C trong vòng 6 tháng.
CHÚ THÍCH: Lượng cân trên phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 µg/ml sau khi đã tính toán và hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.
4.14 Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp, 10 µg/ml
Hút chính xác 100 µl các dung dịch chuẩn gốc (4.13) vào bình định mức 10 ml (5.9). Định mức tới vạch bằng axetonitril (4.2). Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C trong vòng 1 tháng.
4.15 Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp, 1 µg/ml
Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/ml (4.14) vào bình định mức 10 ml (5.9). Định mức tới vạch bằng axetonitril (4.2). Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C trong vòng 1 tuần.
4.16 Dung dịch nội chuẩn gốc carbendazime d3, 1000 µg/ml
Cho 1ml metanol vào lọ có chứa 1mg chất nội chuẩn carbendazime d3 (4.10) thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 1000 µg/ml. Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 6 tháng.
4.17 Dung dịch nội chuẩn trung gian carbendazime d3, 10 µg/ml
Hút chính xác 100 µl dung dịch nội chuẩn gốc (4.16) vào bình định mức 10 ml (5.9). Định mức tới vạch bằng axetonitril (4.2). Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 3 tháng.
4.18 Dung dịch nội chuẩn trung gian carbendazime d3, 1 µg/ml
Hút chính xác 1 ml dung dịch nội chuẩn trung gian 10 µg/ml (4.17) vào bình định mức 10 ml (5.9). Định mức tới vạch bằng axetonitril (4.2). Dung dịch này được bảo quản ở âm 20 °C trong 1 tháng.
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ 3 tứ cực LC-MS/MS
- Bơm 2 kênh dung môi gradient;
- Detector 3 tứ cực MS/MS;
- Máy tính và phần mềm phân tích;
- Cột sắc ký RP C18, đường kính trong 2,1 mm, chiều dài cột 150 mm, kích thước hạt 5 µm;
- Hệ thống bơm mẫu tự động.
5.2 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,01 mg.
5.3 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 r/min.
5.4 Máy vortex, 400 r/min.
5.5 Tủ sấy, dải nhiệt độ đến 250 °C, sai số ± 0,1 °C.
5.6 Máy lắc ngang, tốc độ 300 lần/min.
5.7 Tủ âm sâu, dải nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 30 °C.
5.8 Micropipet, dung tích 100 µl, 1000 µl.
5.9 Bình định mức, dung tích 10 ml, 50 ml.
5.10 Ống ly tâm, dung tích 50 ml.
5.11 Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml.
5.12 Lọ thủy tinh có nắp, dung tích 250 ml.
5.13 Chai thủy tinh đựng dung môi, dung tích 1000 ml.
5.14 Màng lọc nylon, kích thước lỗ 0,2 µm đường kính 1,3 mm.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Mẫu chưa phân tích phải được bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
Mẫu được lắc đều cho đồng nhất trước khi cân.
7.1 Chuẩn bị mẫu thử
Cân 10 g ± 0,1 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml (5.10);
Cho vào 100 µl nội chuẩn 1 µg/ml (4.18);
Lắc cho đều bằng máy vortex (5.4) sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
7.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mật ong không có dư lượng carbendazime, thiophanat metyl. Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử. Trong một lô mẫu chuẩn bị tối thiểu một mẫu trắng.
7.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng có bổ sung 100 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 µg/ml (4.15) và 100 µl nội chuẩn 1 µg/ml (4.18) để thu được nồng độ chuẩn của mẫu kiểm soát là 10 ng/g và nồng độ nội chuẩn là 10 ng/g. Lắc cho đều bằng máy vortex (5.4) sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
7.4 Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn được lập dựng trên mẫu trắng (7.2) được thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau. Cho lần lượt các dung dịch chuẩn và nội chuẩn theo Bảng 1, lắc 15 s bằng máy vortex (5.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo như đối với mẫu thử.
Bảng 1 - Nồng độ các dung dịch chuẩn dùng để xây dựng đường chuẩn
| STT | Nồng độ chuẩn trong mẫu (µg/kg) | Thể tích chuẩn (4.15) thêm vào (µl) | Thể tích chuẩn (4.14) thêm vào (µl) | Thể tích nội chuẩn (4.18) thêm vào (µl) |
| 1 | 0 | 0 |
| 100 |
| 2 | 7,5 | 75 |
| 100 |
| 3 | 15 | 150 |
| 100 |
| 4 | 30 |
| 30 | 100 |
| 5 | 60 |
| 60 | 100 |
| 6 | 120 |
| 120 | 100 |
7.4.1 Tính hệ số tín hiệu
| Tính cho chất cần phân tích theo công thức: | RF= | Sp |
|
| SpIS |
|
Trong đó: RF: hệ số tín hiệu;
Sp: tổng diện tích pic của các ion con của chất cần phân tích;
SpIS: diện tích pic của ion con của nội chuẩn.
7.4.2 Xây dựng đường chuẩn
Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu và chuẩn bị mẫu theo mục 7.4. Phương trình đường chuẩn có dạng có dạng: RF = ax + b. Trong đó:
RF là hệ số tín hiệu, tính theo điều 7.4.1;
x là nồng độ chất chuẩn, tính theo đơn vị µg/l;
b là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;
a là hệ số góc của đường chuẩn.
8.1 Chiết mẫu và làm sạch mẫu
Cho 10 ml nước cất vào mẫu thử (7.1). Thêm 10 ml 1% axit axetic trong axetonitril (4.11), lắc bằng máy vortex (5.4) trong 1 min, lắc bằng máy lắc ngang (5.6) trong 15 min. Thêm 1 g natri axetat (4.6) và 4 g magie sulfat (4.7), tiếp tục lắc bằng máy voltex (5.4) trong 1 min. Ly tâm ống bằng máy ly tâm (5.3) trong 10 min ở tốc độ 4000 r/min. Hút dịch chiết lớp trên, lọc bằng màng lọc (5.14), đưa vào lọ đựng mẫu (5.11). Tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS (5.1).
8.2 Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS/MS
8.2.1 Yêu cầu chung
Chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế mao quản, điện thế đầu cone, năng lượng va chạm, tốc độ khí va chạm để mỗi chất phân tích thu được tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.
8.2.2 Điều kiện trên LC
Nhiệt độ cột: (40 ± 5) °C
Tốc độ dòng: 0,2 ml/min
Thể tích bơm mẫu: 5 µl
Thời gian phân tích: 10 min
Pha động: Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2
Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC
| Thời gian (min) | Kênh A | Kênh B |
| Nước + 0,01% axit formic | Axetonitril + 0,01% axit formic | |
| 0,0 | 0,2 | 95 |
| 0,5 | 0,2 | 95 |
| 6,0 | 0,2 | 5 |
| 7,0 | 0,2 | 5 |
| 7,5 | 0,2 | 95 |
| 10 | 0,2 | 95 |
8.2.3 Điều kiện trên MS:
| Kiểu ion hóa: | ESI (+) |
| Nhiệt độ nguồn ion hóa: | 150 °C |
| Nhiệt độ hóa hơi dung môi: | 500 °C |
| Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: | 600 l/h |
| Tốc độ dòng khí qua khối nón: | 50 l/h |
| Áp suất khí va chạm: | Argon, p = 2,93x10-3 mbar |
| Điện thế mao quản: | 2,0 kV |
Bảng 3 - Điều kiện phân mảnh MS/MS
| STT | Kháng sinh | Thời gian lưu (min) | Ion mẹ (m/z) | Ion con (m/z) | Năng lượng va chạm CE (eV) | Năng lượng (Sample Cone) (V) |
| 1 | Thiophanate-metyl | 5,2 | 343,2 | 310,9 | 18 | 20 |
| 150,9* | 10 | |||||
| 2 | Carbendazime | 3,5 | 191,9 | 159,9* | 28 | 24 |
| 131,9 | 18 | |||||
| 3 | Carbendazime d3 | 3,5 | 194,8 | 159,9 | 16 | 24 |
Ghi chú: ion ký hiệu (*) dùng để định lượng.
8.3 Trình tự bơm mẫu
- Bơm dung môi kiểm tra máy: Axetonitril (4.2);
- Bơm các dung dịch để dựng đường chuẩn;
- Bơm mẫu trắng;
- Bơm mẫu kiểm soát;
- Bơm mẫu thử.
9.1 Tính kết quả
Dư lượng chất phân tích trong mẫu thử được tính theo phương pháp đường chuẩn. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu được tính theo công thức sau:
Trong đó:
C là hàm lượng chất phân tích có trong mẫu, tính bằng microgam trên kilogam (µg/kg);
Cx là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lít (µg/l);
V là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);
F là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);
m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).
9.2 Biểu thị kết quả
Kết quả được biểu thị bằng đơn vị µg/kg (ppb) đến hai số sau dấu phẩy.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;
- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;
- Kết quả thử nghiệm thu được.
[1] Qui trình nội bộ VS1/QT/95/TD “Mật ong - Xác định dư lượng carbendazim bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ”
[2] De'bora Tomasini, Maicon R.F. Sampaio, Sergiane S. Caldas, Jaqueline G. Buffon, Fa'bio A. Duarte, Ednei G. Primel, "Simultane ous determ ination of pesticides and 5-hydroxy metyl furfural in honey by the modified QuEChERS method and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry”, Elsavier (2012).
[3] AOAC 2012 Appendix F; Guidline for Standard Method Performance Requirements.
[4] EFSA Journal 2012; 10(4)2685.