TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 11602:2016
THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG N-NITROSAMIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ SỬ DỤNG THIẾT BỊ PHÂN TÍCH NĂNG LƯỢNG NHIỆT
Meat and meat products - Determination of N-nitrosamines content - Gas chromatographic-thermal energy analyzer method (GC-TEA)
Lời nói đầu
TCVN 11602:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 991.28 N-Nitrosamines in minced fish-meat and surimi-meat frankfurters. Gas chromatographic-thermal energy analyzer method;
TCVN 11602:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG N-NITROSAMIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ SỬ DỤNG THIẾT BỊ PHÂN TÍCH NĂNG LƯỢNG NHIỆT
Meat and meat products - Determination of N-nitrosamines content - Gas chromatographic-thermal energy analyzer method (GC-TEA)
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký khí sử dụng thiết bị phân tích năng lượng nhiệt (GC-TEA)để xác định các hợp chất N-nitrosamin [bao gồm N-nitrosodimethylamin (NDMA), N-nitrosopyrrolidin(NPYR) và N-nitrosomorpholin (NMOR)] thịt và sản phẩm thịt.
Phương pháp này có giới hạn phát hiện là 0,2 ng/g và giới hạn định lượng là 5 ng/g trong thịt xay, cá xay, xúc xích thịt, surimi.
Các kết quả thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.
2 Nguyên tắc
Sử dụng hỗn hợp pentan-diclometan để rửa giải các nitrosamin và amin dễ bay hơi ra khỏi cột chứa hỗn hợp Celit, natri sulfat khan và phần mẫu thử, giữ lại trên cột phần nitrit không hòa tan. Cho dịch rửa giải đi qua cột thứ hai chứa Celit dạng axit để loại bỏ các amin. Các nitrosamin được rửa giải ra khỏi cột Celit dạng axit bằng diclometan, dịch rửa giải được cô đặc và các nitrosamin được xác định bằng thiết bị sắc ký khí sử dụng detector phân tích năng lượng nhiệt.
3 Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng phải là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.
3.1 Chất trợ lọc Celit 545, không được rửa bằng axit.
CHÚ THÍCH Chạy mẫu trắng thuốc thử trước khi sử dụng, đặc biệt nếu sử dụng lô Celit mới. Nếu phát hiện các pic sắc ký bị nhiễu thì rửa sơ bộ Celit hai lần bằng diclometan, sau đó sấy 4 h ở 120 oC trong tủ sấy chân không trước khi sử dụng.
3.2 Dung dịch axit phosphoric (H3PO4), 2 M.
Trước khi sử dụng, chiết một lần với thể tích tương đương diclometan (3.4) để loại bỏ các chất nhiễm bẩn.
3.3 Natri sulfat (Na2SO4), dạng hạt, khan.
3.4 Diclometan (CH2CI2) và pentan (C5H12), đã được chưng cất, đựng trong bình thủy tinh.
3.5 Các chất chuẩn N-nitrosamin, NDMA, NPYR, NMOR (có bán sẵn) và NAZET (N-nitrosoazetidin). NAZET được tổng hợp như sau:
Thêm từ từ dung dịch natri nitrit (NaNO2) với lượng nhiều hơn gấp đôi vào dung dịch đẳng mol của azetidin và axit axetic. Cho hỗn hợp hồi lưu trong 2 h, sau đó chưng cất. Bão hòa dịch chưng cất với kali cacbonat (K2CO3), sau đó chiết bằng diclometan (3.4). Làm khô dịch chiết diclometan bằng natri sulfat khan (3.3), sau đó loại bỏ dung môi bằng máy cô quay chân không. NAZET ở dạng dầu, màu vàng nhạt. Khẳng định việc nhận biết NAZET bằng đo phổ khối lượng.
3.6 Dung dịch chuẩn N-nitrosamin
3.6.1 Dung dịch chuẩn gốc N-nitrosamin, 1,0 μg/ml
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 1,0 μg/ml của từng NDMA, NAZET, NPYR và NMOR trong isooctan.
3.6.2 Dung dịch chuẩn làm việc N-nitrosamin, 0,10 μg/ml
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc (3.6.1) bằng diclometan (3.4) đến 0,10 μg/ml. Chuẩn bị dung dịch trước khi sử dụng.
3.7 Dung dịch nội chuẩn NAZET
3.7.1 Dung dịch nội chuẩn gốc NAZET, 1,0 μg/ml
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 1,0 μg/ml của NAZET trong isooctan.
3.7.2 Dung dịch nội chuẩn làm việc NAZET, 0,10 μg/ml
Pha loãng dung dịch nội chuẩn gốc (3.7.1) bằng diclometan (3.4) đến 0,10 μg/ml. Chuẩn bị dung dịch trước khi sử dụng.
3.8 Hạt trợ sôi.
4 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:
4.1 Cối và chày, bằng thủy tinh, dung tích cối 473 ml.
4.2 Cột sắc ký, bằng thủy tinh, dài 350 mm đường kính trong 32 mm, kích thước đầu tip dài 60 mm, đường kính trong 6 mm (được chuẩn bị bằng ống thổi thủy tinh).
4.3 Que nhồi (tamping rod), bằng thủy tinh, dài 450 mm có đĩa ở phía cuối (đầu que) đường kính 12 mm (được chuẩn bị bằng ống thổi thủy tinh).
4.4 Thiết bị bay hơi, Kuderna-Danish (K-D) 250 ml, được trang bị ống cô đặc chia vạch dung tích 4 ml và cột chưng cất micro-Snyder.
4.5 Thiết bị phân tích GC-TEA, máy sắc ký khí kết nối với với detector phân tích GC-TEA, có bẫy lạnh chứa nitơ lỏng, được trang bị cột thủy tinh dài 3 m, đường kính trong 2,6 mm, được nhồi Carbowax 20M-TPA 15 % trên Gas-crom P cỡ hạt 60 mesh đến 80 mesh.
4.6 Pipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.
4.7 Nồi hơi.
4.8 Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ 70 oC.
4.9 Cốc có mỏ, dung tích 250 ml.
4.10 Que khuấy nhỏ, bằng thủy tinh.
4.11 Bình nón, dung tích 125 ml.
4.12 Máy nghiền đĩa, cỡ lỗ 3 mm.
4.13 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
5 Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
6 Cách tiến hành
6.1 Chuẩn bị cột
Cân 10 g Celit (3.1) vào cốc có mỏ dung tích 250 ml (4.9). Thêm 10 ml dung dịch axit phosphoric 2 M(3.2) vào khoảng 3 ml phần mẫu thử và khuấy Celit bằng que khuấy nhỏ bằng thủy tinh (4.10) cho đến khi hỗn hợp mịn và có kết cấu đồng nhất. Rót Celit dạng axit qua phễu vào cột sắc ký bằng thủy tinh(4.2) có nút bông thủy tinh chèn ở đáy. Chèn que nhồi (4.3) qua nền Celit và nhồi Celit tính từ đáy đến chiều cao cuối cùng khoảng 25 mm. Thêm 25 g natri sulfat khan (3.3) vào đỉnh cột.
6.2 Chuẩn bị mẫu thử
Nghiền mẫu thử hai lần qua máy nghiền đĩa (4.12).
6.3 Chiết
Cân 10,0 g ± 0,1 g phần mẫu thử đã nghiền mịn, chính xác đến 0,1 mg, cho vào cối (4.1). Dùng pipet (4.6) thêm 1,0 ml dung dịch nội chuẩn làm việc NAZEt (3.7.2). Thêm 25 g natri sulfat khan (3.3) và trộn đều bằng chày trong khoảng 15 s. Sau đó, thêm 20 g Celit (3.1) và trộn đều lại bằng chày trong khoảng 15 s đến 20 s, hoặc cho đến khi Celit được trộn đều kỹ với phần mẫu thử và natri sulfat. Nghiền toàn bộ hỗn hợp, sử dụng áp lực vừa phải trong khoảng 1 min, sau đó chuyển hết hỗn hợp vào cột thủy tinh thứ hai có nút bông thủy tinh; nén chặt hỗn hợp theo cách tương tự như sử dụng đối với cột thủy tinh đầu tiên (xem 6.1), đến chiều cao cuối cùng khoảng 75 mm. Thêm 25 g natri sulfat khan (3.3) vào đỉnh cột này.
Đặt trực tiếp cột chứa hỗn hợp phần mẫu thử lên trên cột chứa Celit dạng axit sao cho dòng dung môi chảy trực tiếp qua cột vào trong cột chứa Celit dạng axit. Dùng 15 ml hỗn hợp dung môi pentan-diclometan (95 + 5) để tráng cối, chày và que nhồi đã sử dụng và cho dịch tráng lên đỉnh cột có chứa phần mẫu thử. Bổ sung ngay 160 ml hỗn hợp dung môi pentan-diclometan (95 + 5) lên cột. Thu lấy dịch rửa giải đi qua cả hai cột vào bình nón 125 ml (4.11). Khi dung môi từ đỉnh cột ngừng chảy, tháo cột phía trên và loại bỏ lượng chứa bên trong. Cũng loại bỏ cả lượng chứa trong bình nón 125 ml. Thêm 125 ml diclometan (3.4) vào cột còn lại và thu lấy dịch rửa giải vào bình K-D 250 ml được trang bị ống cô đặc 4 ml (4.4). Khi cột ngừng chảy, tháo bình K-D ra, thêm hai hạt trợ sôi (3.8) vào bình, gắn vào cột Snyder ba nhánh và cô đặc dịch rửa giải đến khoảng 4 ml trên nồi hơi (4.7). Sau khi để nguội, tiếp tục cô đặc (thêm hạt trợ sôi mới) đến 1,0 ml bằng cột micro-Snyder (4.4) và nồi cách thủy (4.8) ở nhiệt độ 70 oC.
LƯU Ý: Trong quá trình phân tích, nhiệt độ phòng không được vượt quá 24 oC. Không cô đặc dịch rửa giải dưới dòng nitơ vì các nitrosamin sẽ bị thất thoát.
6.4 Phân tích GC-TEA
Các điều kiện vận hành sau đây được cho là thích hợp:
- Cột thủy tinh: | theo 4.5; |
- Khí mang heli: | tốc độ 35 ml/min; |
- Chương trình nhiệt độ cột: | từ 120 oC đến 220 oC ở tốc độ 4 oC/min; |
- Nhiệt độ bơm: | 200 oC; |
- Nhiệt độ lò TEA: | 450 oC; |
- Áp suất chân không TEA: | 133,32 Pa (1,0 mmHg) |
- Bẫy lạnh nitơ lỏng.
Bơm 9,0 μl dịch rửa giải và đo chiều cao pic.
6.5 Dựng đường chuẩn
Bơm bằng tay 9,0 μl dung dịch chuẩn (3.6.2) nồng độ thấp nhất cho tín hiệu độ đáp ứng TEA ở ít nhất 1/3 toàn thang đo và đo chiều cao pic. Lặp lại quá trình bơm để đảm bảo độ tái lập của thời gian lưu tốt và đáp ứng tốt.
7 Tính kết quả
7.1 Dư lượng N-nitrosamin
Hàm lượng N-nitrosamin trong mẫu thử, X, biểu thị bằng microgam trên kilogam (μg/kg), được tính theo Công thức (1):
(1) |
Trong đó:
R và R’ là chiều cao pic N-nitrosamin trong dịch rửa giải và chất chuẩn, tương ứng;
C là nồng độ N-nitrosamin trong dung dịch chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (trong trường hợp này C = 0,10 μg/ml);
W là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
V là thể tích cuối cùng của dịch rửa giải, tính bằng (trong trường hợp này V = 1,0 ml).
Báo cáo kết quả chính xác đến một chữ số sau dấu phẩy.
7.2 Độ thu hồi của chất nội chuẩn NAZET
Độ thu hồi của chất nội chuẩn NAZET, Y, tính bằng phần trăm (%), được tính theo Công thức (2):
(2) |
Trong đó, RI và R’l là chiều cao pic của NAZET trong dịch rửa giải và trong chất chuẩn.
Nếu độ thu hồi của NAZET nhỏ hơn 60 % thì kết quả đối với các N-nitrosamin khác (NDMA, NPYR và NMOR) không được chấp nhận.
8 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
f) nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
Phụ lục A
(Tham khảo)
Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm
Bảng A.1 - Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm
| Độ lệch chuẩn lặp lại, sr | Độ lệch chuẩn tái lập, sR | Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr % | Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR % |
NDMA được thêm chuẩn ở mức 5 ng/g | 0,56 | 1,40 | 11,5 | 28,9 |
NDMA được thêm chuẩn ở mức 10 ng/g | 0,98 | 2,19 | 10,9 | 24,2 |
NDMA được thêm chuẩn ở mức 15 ng/g | 1,19 | 3,87 | 8,9 | 28,9 |
NDMA nhiễm từ nền mẫu (khoảng 23 ng/kg) | 2,25 | 6,49 | 9,8 | 28,2 |
NPYR được thêm chuẩn ở mức 5 ng/g | 0,48 | 1,12 | 12,5 | 29,5 |
NPRY được thêm chuẩn ở mức 10 ng/g | 0,97 | 2,00 | 12,0 | 24,7 |
NPRY được thêm chuẩn ở mức 15 ng/g | 1,06 | 3,17 | 8,9 | 26,5 |
NMOR được thêm chuẩn ở mức 5 ng/g | 0,55 | 1,18 | 13,3 | 28,5 |
NMOR được thêm chuẩn ở mức 10 ng/g | 1,03 | 2,12 | 12,1 | 24,9 |
NMOR được thêm chuẩn ở mức 15 ng/g | 1,26 | 3,11 | 10,1 | 25,0 |