THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METHYL BENZOQUATE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuffs - Determination of methyl benzoquate content - High performance liquid chromatographic method
Lời nói đầu
TCVN 10809:2015 được xây dựng dựa theo Commission Regulation (EC) No. 152/2009;
TCVN 10809:2015 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METHYL BENZOQUATE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuffs - Determination of methyl benzoquate content - High performance liquid chromatographic method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone) trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao.
Giới hạn định lượng của phương pháp là 1 mg/kg.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi- Chuẩn bị mẫu thử
Methyl benzoquate được chiết ra khỏi mẫu bằng dung dịch axit methanesulfonic trong metanol. Dịch chiết được tinh sạch bằng diclometan, sắc kí trao đổi ion và sau đó tinh sạch lại bằng diclometan. Hàm lượng methyl benzoquate được xác định bằng cách sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo với detector UV.
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.
4.1.Diclometan.
4.2.Metanol, loại dùng cho HPLC.
4.3.Pha động dùng cho HPLC
Hỗn hợp của metanol (4.2) và nước (loại dùng cho HPLC) với tỉ lệ 75 : 25 (thể tích).
Lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,22 mm (5.5) và đuổi khí dung dịch (ví dụ bằng siêu âm trong 10 min).
4.4.Dung dịch axit methanesulfonic, c = 2 %
Pha loãng 20,0 ml axit methanesulfonic bằng metanol (4.2) đến 1000 ml.
4.5.Dung dịch axit clohydric, c = 10 %
Pha loãng 100 ml axit clohydric (r20 = 1,18 g/ml) bằng nước đến 1000 ml.
4.6.Nhựa trao đổi cation amberlite CG-120 (Na), cỡ 100 mesh đến 200 mesh
Nhựa được xử lý trước khi sử dụng. Trộn 100 g nhựa với 500 ml dung dịch axit clohydric (4.5) và đun sôi trên bếp điện, khuấy liên tục. Để nguội và gạn bỏ axit. Lọc qua giấy lọc trong điều kiện chân không. Rửa nhựa hai lần mỗi lần 500 ml nước và sau đó rửa bằng 250 ml metanol (4.2). Rửa tiếp bằng 250 ml metanol và làm khô bằng cách cho không khí đi qua phần nhựa thu được. Bảo quản nhựa khô trong chai đậy kín.
4.7.Chất chuẩn: methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone) tinh khiết
4.7.1.Dung dịch chuẩn gốc methyl benzoquate, 500 mg/ml
Cân 50 mg chất chuẩn (4.7), chính xác đến 0,1 mg, hòa tan trong dung dịch axit methanesulfonic (4.4) trong bình định mức 100 ml, thêm dung dịch axit methanesulfonic đến vạch và trộn đều.
4.7.2.Dung dịch chuẩn trung gian methyl benzoquate, 50 mg/ml
Chuyển 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc methyl benzoquate (4.7.1) vào bình định mức 50 ml, thêm metanol (4.2) đến vạch và trộn đều.
4.7.3.Dung dịch hiệu chuẩn
Chuyển 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml và 5,0 ml dung dịch chuẩn trung gian methyl benzoquate (4.7.2) vào một loạt các bình định mức 25 ml. Thêm pha động (4.3) đến vạch và trộn. Các dung dịch này có nồng độ methyl benzoquate tương ứng 2,0 mg/ml, 4,0 mg/ml, 6,0 mg/ml, 8,0 mg/ml và 10,0 mg/ml. Các dung dịch này cần được chuẩn bị mới trước khi sử dụng.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:
5.1.Máy lắc phòng thử nghiệm.
5.2.Bộ cô quay.
5.3.Cột thủy tinh, kích thước 250 mm x 15 mm, có khóa vòi và dung tích cột khoảng 200 ml.
5.4.Thiết bị HPLC, có detector UV có thể thay đổi bước sóng hoặc detector mảng diot.
5.4.1.Cột sắc kí lỏng, kích thước 300 mm x 4 mm, C18, cỡ hạt nhồi 10 mm hoặc loại tương đương.
5.5.Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,22 mm.
5.6.Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 mm.
5.7.Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml.
5.8.Phễu chiết, dung tích 500 ml và 1 lít.
5.9.Bình cầu đáy tròn, dung tích 500 ml.
5.10.Bình nón, dung tích 250 ml.
5.11.Cân, có thể cân được 50 mg, chính xác đến 0,1 mg.
5.12.Cân, có thể cân được 20 g, chính xác đến 0,01 g.
5.13.Cân, có thể cân được 100 g, chính xác đến 0,1 g.
5.14.Pipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.
Mẫu phải đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.
Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).
8.1.Yêucầu chung
8.1.1.Mẫu trắng
Cần phân tích mẫu trắng để chắc chắn rằng không có mặt methyl benzoquate hoặc chất gây nhiễu.
8.1.2.Kiểm tra độ thu hồi
Kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu trắng được bổ sung một lượng methyl benzoquate tương tự lượng dự kiến đó có mặt trong mẫu. Để bổ sung ở mức 15 mg/kg, chuyển 600 ml dung dịch chuẩn gốc (4.7.1) vào 20 g mẫu trắng, trộn và đợi 10 min trước khi tiếp tục quá trình chiết (8.2).
Mẫu trắng phải cùng loại với mẫu thử và không phát hiện được sự có mặt của methylbenzoquate.
8.2.Chiết
Cân khoảng 20 g mẫu đã chuẩn bị, chính xác đến 0,01 g và chuyển sang bình nón (5.10). Thêm100,0 ml dung dịch axit methanesulfonic (4.4) và lắc bằng máy lắc (5.1) trong 30 min. Lọc dung dịch qua giấy lọc và giữ lại phần dịch lọc cho bước tách pha lỏng-lỏng (8.3).
8.3.Tách pha lỏng-lỏng
Chuyển 25,0 ml dịch lọc thu được trong (8.2) vào phễu chiết 500 ml (5.8) có chứa 100 ml dung dịch axit clohydric (4.5). Thêm 100 ml diclometan (4.1) vào phễu chiết và lắc trong 1 min. Để cho tách lớp và tháo lớp phía dưới (diclometan) vào bình cầu đáy tròn 500 ml (5.9). Lặp lại việc chiết pha nước hai lần mỗi lần 40 ml diclometan và gộp lại với phần chiết đầu tiên vào bình cầu đáy tròn. Cho bay hơi chất chiết diclometan đến khô trên thiết bị cô quay (5.2) dưới áp suất giảm ở 40°C. Hòa tan cặn trong 20 ml đến 25 ml metanol (4.2), đậy bình cầu và giữ lại toàn bộ phần dịch chiết để phân tích sắc kí trao đổi ion (8.4).
8.4.Sắc kí trao đổi ion
8.4.1.Chuẩn bị cột trao đổi cation
Chèn một nút bông thủy tinh vào đầu dưới của cột thủy tinh (5.3). Chuẩn bị hồ nhão của 5,0 g nhựa trao đổi cation đã được xử lý trước (4.6) với 50 ml dung dịch axit clohydric (4.5), đổ vào cột thủy tinh và để cho lắng xuống. Tháo bớt axit thừa, chỉ để cho axit đủ ngập trên bề mặt nhựa và rửa cột với nước cho đến khi nước rửa trung tính với quỳ. Chuyển 50 ml metanol (4.2) vào cột và tháo metanol rút xuống bề mặt nhựa.
8.4.2.Sắc kí cột
Dùng pipet chuyển cẩn thận dịch chiết thu được trong (8.3) vào cột. Rửa sạch bình cầu đáy tròn hai lần mỗi lần dùng 5 ml đến 10 ml metanol (4.2) và chuyển nước rửa vào cột. Cho dịch chiết chảy xuống bề mặt nhựa và rửa cột bằng 50 ml metanol, đảm bảo tốc độ dòng không vượt quá 5 ml/min. Loại bỏ nước rửa.. Rửa giải methyl benzoquate ra khỏi cột bằng 150 ml dung dịch axit methanesulfonic (4.4) và thu lấy dịch rửa giải cột vào bình nón 250 ml (5.9).
8.5.Tách pha lỏng-lỏng
Chuyển dịch rửa giải thu được (8.4.2) vào phễu chiết 1 lít (5.8). Rửa sạch bình nón bằng 5 ml đến 10 ml metanol (4.2) và gộp nước rửa vào lượng chứa trong phễu chiết. Thêm 300 ml dung dịch axit clohydric (4.5) và 130 ml diclometan (4.1). Lắc 1 min và để yên cho tách pha. Tháo lớp phía dưới (diclometan) cho chảy vào bình cầu đáy tròn 500 ml. Lặp lại việc chiết pha nước hai lần mỗi lần 70 ml dicloromethan và gộp các dịch chiết này với phần dịch chiết đầu tiên trong bình cầu đáy tròn.
Cho bay hơi dịch chiết diclometan đến khô trên bộ cô quay (4.2) dưới áp suất giảm ở 40°C. Hòa tan cặn trong bình cầu bằng khoảng 5 ml metanol (4.2) và chuyển định lượng dung dịch này sang bình định mức 10 ml. Rửa bình cầu đáy tròn hai lần mỗi lần 1 ml đến 2 ml metanol và chuyển sang bình định mức. Thêm metanol đến vạch và trộn. Phần dịch nước được lọc qua bộ lọc màng (5.6). Dung dịch này dùng để xác định bằng HPLC (8.6).
8.6.Xác định bằng HPLC
8.6.1.Thông số
Nên sử dụng các điều kiện sau đây, có thể sử dụng các điều kiện khác nếu cho kết quả tương đương:
- Cột sắc kí lỏng (5.4.1);
- Pha động HPLC: hỗn hợp metanol-nước (4.3);
- Tốc độ dòng: từ 1 ml/min đến 1,5 ml/min;
- Thể tích bơm: 20 ml đến 50 ml,
- Bước sóng phát hiện: 265 nm;
Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc kí bằng cách bơm vài lần dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) có nồng độ 4 mg/ml, cho đến khi đạt được chiều cao (diện tích) pic và thời gian lưu ổn định.
8.6.2. Dựng đường chuẩn
Bơm mỗi dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) vài lần và xác định chiều cao (diện tích) pic đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chuẩn bằng cách sử dụng chiều cao (diện tích) pic trung bình của dung dịch hiệu chuẩn trên trục tung và nồng độ tương ứng tính bằng mg/ml trên trục hoành.
8.6.3.Dung dịch mẫu
Bơm vài lần dịch chiết mẫu thu được trong 8.5, sử dụng cùng một thể tích như đã dùng đối với dung dịch hiệu chuẩn và xác định chiều cao (diện tích) trung bình của pic methyl benzoquate.
Xác định nồng độ methyl benzoquate có trong dung dịch mẫu từ chiều cao (diện tích) pic trung bình có trong dung dịch mẫu, sử dụng đường chuẩn (8.6.2).
Tính hàm lượng methyl benzoquate trong mẫu, w(mg/kg), theo công thức sau:
w =
Trong đó:
c là nồng độ methyl benzoquate trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);
40 là thể tích dung dịch thu được từ 8.5 tương ứng với phần mẫu thử ban đầu (m), tính bằng mililit (ml);
m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).
10.1.Nhận biết
Việc nhận biết chất phân tích có thể được khẳng định bằng đồng sắc kí hoặc sử dụng detector mảng diot để so sánh phổ đồ của dịch chiết mẫu (8.2) và của dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) có nồng độ 10 mg/ml.
10.1.1.Đồng sắc kí
Bổ sung một thể tích thích hợp dung dịch chuẩn trung gian (4.7.2) vào dịch chiết mẫu. Lượng methyl benzoquate bổ sung phải xấp xỉ hàm lượng methyl benzoquate dự kiến tìm thấy trong dịch chiết mẫu.
Chỉ có chiều cao pic methyl benzoquate tăng sau khi tính cả lượng bổ sung và độ pha loãng của dịch chiết. Sai khác và chiều rộng pic tại điểm giữa chiều cao phải nằm trong phạm vi ± 10 % chiều rộng gốc.
10.1.2.Detector mảng diot
Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau:
a) tại bước sóng tương ứng với độ hấp thụ cực đại, phổ đồ của mẫu và của chất chuẩn, được ghi lại ở đỉnh cao nhất trên sắc kíđồ, phải giống nhau trong một biên độ được xác định bằng khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diot, biên độ đặc trưng là ± 2 nm;
b) tại bước sóng từ 220 nm đến 350 nm, phổ đồ của mẫu và của chất chuẩn được ghi lại ở đỉnh cao nhất trên sắc kí đồ không được khác với các phần phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của chất phân tích chuẩn;
c) tại bước sóng từ 220 nm đến 350 nm, phổ đồ của điểm uốn lên, đỉnh cao nhất và điểm uốn xuống của pic chất phân tích không được khác với các phần phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ tương ứng với phổ đồ của đỉnh cao nhất.
Nếu một trong các tiêu chí này không đáp ứng thì không xác nhận được sự có mặt của chất phân tích trong mẫu.
11.1.Độ lặp lại
Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá 10 % giá trị cao hơn khi hàm lượng methyl benzoquate trong khoảng từ 4 mg/kg đến 20 mg/kg.
11.2.Độthuhồi
Đối với các mẫu thức ăn chăn nuôi (mẫu trắng) được thêm chuẩn, độ thu hồi ít nhất là 90 %.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thểảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.
(Tham khảo)
KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ NGHIỆM CỘNG TÁC
Một nghiên cứu cộng tác đã được tổ chức thực hiện trên năm mẫu. Mỗi mẫu đã thực hiện hai phép phân tích lặp lại.
Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác được nêu trong Bảng A.1.
Bảng A.1 - Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác
| Mẫu trắng | Dạng bột 1 | Dạng viên 1 | Dạng bột 2 | Dạng viên 2 |
Giá trị trung bình [mg/kg] | Không phát hiện | 4,50 | 4,50 | 8,90 | 8,70 |
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, [mg/kg] | - | 0,30 | 0,20 | 0,60 | 0,50 |
Hệ số biến thiên lặp lại, CVr, [%] | - | 6,70 | 4,40 | 6,70 | 5,70 |
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, [mg/kg] | - | 0,40 | 0,50 | 0,90 | 1,00 |
Hệ số biến thiên tái lập, CVR [%] | - | 8,90 | 11,10 | 10,10 | 11,50 |
Độ thu hồi [%] | - | 92,00 | 93,00 | 92,00 | 89,00 |