Food additives - Nisin
Lời nói đầu
TCVN 10637:2015 được xây dựng dựa trên cơ sở JECFA (2013), Nisin;
TCVN 10637:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
PHỤ GIA THỰC PHẨM - NISIN
Food additives - Nisin
Tiêu chuẩn này áp dụng cho hợp chất nisin được sử dụng làm phụ gia thực phẩm.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6469:2010, Phụ gia thực phẩm - Phương pháp đánh giá ngoại quan và xác định các chỉ tiêu vật lý
TCVN 8900-2:2012, Phụ gia thực phẩm - Xác định các thành phần vô cơ - Phần 2: Hao hụt khối lượng khi sấy, hàm lượng tro, chất không tan trong nước và chất không tan trong axit
TCVN 8900-6:2012, Phụ gia thực phẩm - Xác định các thành phần vô cơ - Phần 6: Định lượng antimon, bari, cadimi, crom, đồng, chì và kẽm bằng đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa
TCVN 8900-8:2012, Phụ gia thực phẩm - Xác định các thành phần vô cơ - Phần 8: Định lượng chì và cadimi bằng đo phổ hấp thụ nguyên tử dùng lò graphit
JECFA 2006, Combined compendium of food additive specifications, Volume 4: Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and referenced in the food additive specifications (Tuyển tập quy định kỹ thuật đối với phụ gia thực phẩm, Tập 4: Các phương pháp phân tích, quy trình thử nghiệm và dung dịch phòng thử nghiệm được sử dụng và viện dẫn trong các yêu cầu kỹ thuật đối với phụ gia thực phẩm)
3.1. Thuật ngữ và định nghĩa
3.1.1. Nisin (nisin)
Hỗn hợp của các polypeptit tương tự có tính kháng khuẩn được hình thành bởi chủng vi khuẩn Lactococcus lactis subsp. lactis trong điều kiện lên men thích hợp. Polypeptit chủ yếu có được từ quá trình lên men là nisin A.
Nisin được tạo thành trong môi trường tiệt trùng bao gồm sữa bột không béo hoặc sản phẩm lên men không chứa sữa như chất chiết nấm men và chất khô cacbohydrat. Thời gian và pH của quá trình lên men được kiểm soát cho đến khi đạt được lượng nisin tối ưu. Từ môi trường lên men, nisin được cô đặc, thu hồi và tinh sạch bằng các phương pháp khác nhau như hút vô trùng, lọc màng, axit hóa, tách chiết bằng muối, siêu lọc hoặc sấy phun. Nisin đã tinh sạch được tiêu chuẩn hóa bằng natri clorua để đạt được hoạt độ mong muốn trong chế phẩm nisin.
Nisin ổn định trong không khí và khi được gia nhiệt trong điều kiện axit (cho đến pH = 3). Chế phẩm nisin thương mại chứa hàm lượng nisin là 2,5 % (khối lượng) và hàm lượng natri clorua lớn hơn 50 %, các thành phần còn lại của chế phẩm là chất khô sữa và các sản phẩm lên men bao gồm protein và cacbohydrat.
3.1.2. Hoạt độ nisin (activity of nisin)
Lượng nisin cần để kìm hãm sự phát triển của 1 tế bào vi khuẩn trong 1 ml canh thang.
Hoạt độ nisin được biểu thị bằng đơn vị quốc tế (IU). 1 IU nisin tương đương với 0,025 µg.
3.2. Kí hiệu
INS (mã số quốc tế về phụ gia thực phẩm): 234
C.A.S (mã số hóa chất): 1414-45-5
3.3. Công thức hóa học: C143H230O37N42S7
3.4. Công thức cấu tạo (xem Hình 1)
CHÚ DẪN: Abu : axit alpha-aminobutyric, Dha : dehydroalanin, Dhb : dehydrobutyrin
Hình 1 - Công thức cấu tạo của nisin
3.5. Khối lượng phân tử: Khoảng 3 354
3.6. Chức năng sử dụng: Chất bảo quản kháng vi sinh vật.
CHÚ THÍCH: Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được (ADI) của nisin là từ 0 mg/kg thể trọng đến 2 mg/kg thể trọng.
4.1. Nhận biết
4.1.1. Ngoại quan
Bột mịn, màu trắng đến màu nâu sáng.
4.1.2. Độ hòa tan
Tan được trong nước và không tan trong các dung môi không phân cực.
CHÚ THÍCH: Theo TCVN 6469:2010, một chất được coi là “tan được” nếu cần từ 10 đến dưới 30 phần dung môi để hòa tan 1 phần chất tan, một chất “không tan” nếu cần từ 10 000 phần dung môi trở lên để hòa tan 1 phần chất tan.
4.1.3. Phân biệt với các chất kháng khuẩn khác
Phải có phản ứng đặc trưng khác biệt với các chất kháng khuẩn khác.
4.1.4. Hoạt độ nisin
Mẫu thử có hoạt tính của nisin.
4.2. Các chỉ tiêu lí - hóa
Các chỉ tiêu lí - hóa của nisin theo quy định trong Bảng 1.
Bảng 1 - Chỉ tiêu lí - hóa của nisin
|
Tên chỉ tiêu |
Mức |
|
1. Hoạt độ nisin, IU/mg, không nhỏ hơn |
900 a) |
|
2. Hao hụt khối lượng sau khi sấy ở 105 0C trong 2 h, % khối lượng, không lớn hơn |
3,0 |
|
3. Hàm lượng natri clorua, % khối lượng, không nhỏ hơn |
50 |
|
4. Hàm lượng chì, mg/kg, không lớn hơn |
1,0 |
|
a) Tương đương với hàm lượng nisin 22,5 μg/mg. |
|
4.3. Các chỉ tiêu vi sinh
Các chỉ tiêu vi sinh của nisin theo quy định trong Bảng 2.
Bảng 2 - Chỉ tiêu vi sinh của nisin
|
Tên chỉ tiêu |
Giới hạn |
|
1. Salmonella |
Không được có trong 25 g mẫu |
|
2. Coliform tổng số |
Không lớn hơn 30 CFU trong 1 g mẫu |
|
3. Escherichia coli |
Không được có trong 25 g mẫu |
5.1. Xác định độ hòa tan, theo 3.7 của TCVN 6469:2010.
5.2. Phép thử phân biệt với các chất kháng khuẩn khác
5.2.1. Độ bền trong môi trường axit
Cho 1 g mẫu thử vào 1 lít dung dịch axit clohydric (HCl) 0,02 N để thu được dung dịch 1 000 IU/ml.
Pha loãng dung dịch 1 000 IU/ml bằng axit clohydric 0,02 N đến nồng độ 50 IU/ml. Đun sôi dung dịch này trong 5 min và xác định hoạt độ nisin theo 5.3.
Nồng độ nisin tính được trong mẫu đun sôi phải đạt 100 % (± 5 %) giá trị định lượng cho biết hoạt độ tổn thất không đáng kể sau quá trình xử lí nhiệt này.
5.2.2. Độ không bền trong môi trường kiềm
Chỉnh pH của dung dịch nisin đến 11 bằng cách thêm dung dịch natri hydroxit (NaOH) 5 N. Gia nhiệt dung dịch ở 65 oC trong 30 min, sau đó để nguội. Chỉnh pH đến 2 bằng cách nhỏ từng giọt dung dịch axit clohydric. Xác định lại hoạt độ nisin theo 5.3.
Hoạt tính kháng khuẩn của nisin mất hoàn toàn sau quá trình xử lý này.
5.2.3. Khả năng tồn tại của vi khuẩn Lactococcus lactis trong môi trường có nồng độ nisin cao
Chuẩn bị các chủng Lactococcus lactis (ATCC 11454, NCIMB 8586) trong sữa đã tách chất béo tiệt trùng (chất béo sữa < 1 %) và ủ ấm trong 18 h, nhiệt độ 30 0C. Chuẩn bị một hoặc nhiều bình nón chứa 100 ml sữa quỳ (litmus milk), tiệt trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 min. Cho 0,1 g mẫu vào sữa quỳ đã được tiệt trùng và để ở nhiệt độ phòng trong 2 h. Thêm vào 0,1 ml môi trường L. lactis và ủ ở 30 0C trong 24 h. Vi khuẩn L. lactis sẽ phát triển trong dịch mẫu có nồng độ khoảng 1 000 IU/ml; tuy nhiên, vi khuẩn L. lactis sẽ không phát triển ở các nồng độ tương tự của các chất kháng khuẩn khác.
Phép thử này không phân biệt được nisin và subtilin.
5.3. Xác định hoạt độ nisin
5.3.1. Thuốc thử và vật liệu thử
5.3.1.1. Chuẩn bị vi khuẩn thử
Dùng que cấy chuyển Lactococcus lactis subsp. cremoris (ATCC 14365, NCDO 495) được nuôi cấy hàng ngày trong sữa đã tách chất béo tiệt trùng vào lọ McCartney có chứa sữa quỳ và ủ ở 30 0C. Chuẩn bị sữa chứa vi khuẩn cho phép thử bằng cách cấy 2 % dịch nuôi vi khuẩn 24 h vào lượng tỷ lệ phù hợp sữa đã tách béo tiệt trùng, đặt vào nồi cách thủy ở 30 0C trong 90 min. Sau đó đem dùng ngay.
5.3.1.2. Dung dịch chuẩn gốc
Cân chính xác một lượng chuẩn nisin, hòa tan trong dung dịch axit clohydric 0,02 N để tạo thành dung dịch 5 000 IU/ml. Ngay trước khi dùng, pha loãng dung dịch này bằng axit clohydric 0,02 N để thu được dung dịch 50 IU/ml.
CHÚ THÍCH: Chế phẩm nisin của hãng Sigma, St Louis, USA hoặc Fluka, Buchs, Thụy Sĩ chứa hàm lượng nisin 2,5 % khối lượng với hoạt độ tối thiểu 106 IU/g. Cũng có thể sử dụng chế phẩm Nisaplin của DuPont Nutrition Biosciences, Copenhagen, Đan Mạch chứa hoạt độ tối thiểu 3 x 106 IU/g làm dung dịch chuẩn gốc.
5.3.1.3. Dung dịch resazurin, 0,0125 % (khối lượng/thể tích)
Chuẩn bị dung dịch trong nước ngay trước khi dùng.
5.3.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
Cân một lượng mẫu đủ để đảm bảo các ống tương ứng của mẫu phù hợp với dãy dung dịch chuẩn, nghĩa là với các giới hạn chặt chẽ, hàm lượng nisin trong mẫu và chuẩn là như nhau. Pha loãng dung dịch mẫu bằng dung dịch axit clohydric 0,02 N đến hoạt độ nisin 50 IU/ml.
5.3.3. Cách tiến hành
Dùng pipet lấy các thể tích (0,60; 0,55; 050; 0,45; 0,41; 0,38; 0,34; 0,31; 0,28; 0,26 ml) của dung dịch mẫu 50 IU/ml (5.3.2) và dung dịch chuẩn (5.3.1.2) cho vào hai hàng 10 ống nghiệm vi sinh đã được làm khô, kích thước ống 6 inch x 5/8 inch1). Bổ sung 4,6 ml sữa đã cấy vi khuẩn (5.3.1.1) vào từng ống bằng thiết bị pipet tự động. Việc bổ sung sữa đã cấy vi khuẩn phải thực hiện vào từng hàng ống có cùng nồng độ mà không theo từng hàng có 10 ống.
Đặt các ống vào nồi cách thủy ở nhiệt độ 30 0C trong 15 min, sau đó làm nguội trong bể nước đá trong khi thêm vào 1 ml dung dịch resazurin (5.3.1.3) cho mỗi ống, theo thứ tự như khi bổ sung sữa đã cấy vi khuẩn, sử dụng pipet tự động. Lắc đều các ống. Tiếp tục ủ thêm từ 3 min đến 5 min ở nhiệt độ 30 0C trong nồi cách thủy.
Kiểm tra các ống dung dịch chuẩn và dung dịch thử bằng ánh sáng huỳnh quang trong buồng tối. Ống mẫu có nồng độ cao nhất phân biệt rõ trước tiên thông qua màu sắc (ví dụ: chuyển từ màu xanh sang màu hoa cà) được so sánh với các ống trong dãy chuẩn để tìm ra được sự đồng màu nhất. Tìm sự phù hợp ở hai nồng độ thấp hơn kế tiếp của mẫu và chuẩn. Nội suy sự phù hợp ở các bước pha loãng một nửa. Thu được 3 số đọc nồng độ của dung dịch thử và tính giá trị trung bình. Tính hoạt độ nisin trong mẫu thử từ các hoạt độ nisin chuẩn.
Chuyển đổi hoạt độ nisin từ IU sang microgam nisin theo hệ số chuyển đổi 1 IU = 0,025 μg.
5.4. Xác định hao hụt khối lượng sau khi sấy, theo 5.1 của TCVN 8900-2:2012.
5.5. Xác định hàm lượng natri clorua
5.5.1. Thuốc thử
5.5.1.1. Axit nitric đặc.
5.5.1.2. Nitrobenzen.
5.5.1.3. Dung dịch bạc nitrat, 0,1 N.
5.5.1.4. Thuốc thử sắt (III) amoni sulfat [FeNH4(SO4)2.12H2O] trong nước, 8 % (khối lượng/thể tích).
5.5.1.5. Dung dịch amoni thiocyanat, 0,1 N.
5.5.1.6. Nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương.
5.5.2. Thiết bị, dụng cụ
5.5.2.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
5.5.2.2. Pipet.
5.5.2.3. Buret.
5.5.3. Cách tiến hành
Cân khoảng 200 mg mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình thủy tinh có nắp đậy, chứa sẵn 50 ml nước. Khuấy để hòa tan mẫu đồng thời thêm 3 ml axit nitric (5.5.1.1), 5 ml nitrobenzen (5.5.1.2), 50,0 ml dung dịch bạc nitrat 0,1 N (5.5.1.3) đã chuẩn hóa và 2 ml thuốc thử sắt (III) amoni sulfat (5.5.1.4). Khuấy dung dịch và chuẩn độ lượng bạc nitrat dư bằng dung dịch amoni thiocyanat 0,1 N (5.5.1.5). Kết thúc chuẩn độ khi xuất hiện màu đỏ.
5.5.4. Tính kết quả
Hàm lượng natri clorua có trong mẫu thử, X, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo công thức sau:
Trong đó:
58,44 là khối lượng mol của natri clorua, tính bằng gam trên mol (g/mol);
50 là thể tích của dung dịch bạc nitrat, tính bằng mililit (ml);
CA là nồng độ của dung dịch bạc nitrat;
V là thể tích dung dịch amoni thiocyanat, tính bằng mililit (ml);
CB là nồng độ của dung dịch amoni thiocyanat;
w là khối lượng mẫu thử, tính bằng miligam (mg).
5.6. Xác định hàm lượng chì, theo TCVN 8900-6:2012 hoặc TCVN 8900-8:2012.
5.7. Xác định Salmonella, theo JECFA 2006, Volume 4.
5.8. Xác định coliform tổng số, theo JECFA 2006, Volume 4.
5.9. Xác định Escherichia coli, theo JECFA 2006, Volume 4.