HÀM LƯỢNG CLORAMPHENICOL TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ
Chloramphenicol in fishery products - Method for quantltative analysis by Gas Chromatography
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng cloramphenicol (sau đây gọi tắt là CAP) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 m g/kg.
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp được công bố trong tạp chí của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích; tập 77, số 3, năm 1994 (Journal of AOAC intemational; Voi. 77, No. 3, 1994: Gas chromatographic determination of chloramphenicol residues in shrimp).
CAP trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng etyl axetat. Dịch chiết sau đó được cô cạn, cặn được xử lý với sylon (chất tạo dẫn xuất trimetylsylyl), để tạo dẫn xuất trimetylsylyl của CAP. Hàm lượng dẫn xuất CAP được xác định trên hệ thống GC với đầu dò bắt giữ điện tử (sau đây gọi tắt là ECD) theo phương pháp nội chuẩn.
4. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử
4.1. Thiết bị, dụng cụ
4.1.1. Hệ thống GC với đầu dò ECD và bộ phận tiêm mẫu tự động.
4.1.2. Cột mao quản HP-5, kích thước 25m x 02 mm, lớp film 5% phenyl metyl silicon dày 0,33 m m hoặc cột tương đương.
4.1.3. Hệthống cô quay chân không: Bu chi R 110 hoặc tương đương.
4.1.4. Hệ thống cô N – Evap model 111 hoặc tương đương.
4.1.5. Xi lanh 10 m l.
4.1.6. Bình quả lê dung tích 100 ml.
4.1.7. Ống ly tâm dung tích 15 ml, 50 ml.
4.1.8. Pipet Pasteur với quả bóp cao su.
4.1.9. Máy ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút.
4.1.10. Máy rung trộn mẫu.
4.1.11. Máy nghiền đồng thể
4.1.12. Bể điều nhiệt.
4.2. Hóa chất
Hóa chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm:
4.2.1. Etyl axetat.
4.2.2. Nước loại dùng cho HPLC.
4.2.3. He xan.
4.2.4. Toluen.
4.2.5. Na tri clorua (NACl)
4.2.6. Tác nhân tạo dẫn xuất Trimetyl silyl: Sylon HTP kit.
4.2.7.Chuẩn CAP.
4.2.8. Chất nội chuẩn m-nitro CAP (M-CAP).
4.2.9. Metanol.
4.3. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử
4.3.1. Dung dịch muối 4%: hòa tan 40 g NACl (4.2.5) trong 1000 ml nước cất (4.2.2).
4.3.2. Dung dịch nội chuẩn CAP gốc (100 m g/ml): cân 10,0 mg CAP (4.2.7) vào bình định mức dung tích 100 ml. Hòa tan và định mức đến vạch 100 ml bằng metanol (4.2.9).
4.3.3. Dung dịch nội chuẩn CAP làm việc (1000 ng/ml): hút chính xác 1,00 ml dung dịch chuẩn CAP gốc (4.3.2) vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng Metanol (4.2.9).
4.3.4. Dung dịch chuẩn M-CAP gốc (100 ng/ml ): cân 10,0 mg M-CAP (4.2.8) vào bình định mức 100 ml. Hòa tan và định mức đến vạch 100 ml bằng metanol (4.2.9).
4.3.5. Dung dịch chuẩn M-CAP làm việc (1000 ng/ml): hút chính xác 1,00 ml dung dịch chuẩn M- CAP gốc (4.3.4) vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng metanol (4.2.9).
4.3.6. Dung dịch các chuẩn đã được tạo dẫn xuất: hút chính xác 100m l dung dịch từ các chuẩn làm việc (4.3.3) và (4.3.5) vào ống ly tâm 15 ml (4.1.7). Làm khô bằng dòng nitơ. Tạo dẫn xuất như được mô tả ở tại Điều 5.4, nhưng thể tích cuối cùng là 1,0 ml.
4.3.7. Dung dịch CAP (100 ng/ml): hút chính xác 10,0 ml dung dịch chuẩn CAP làm việc (4.3.3) vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng metanol (4.2.9).
4.3.8. Dung dịch M-CAP (100 ng/ml): hút chính xác 10,0 ml dung dịch nội chuẩn M-CAP làm việc (4.3.5) vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng metanol (4.2.9).
5.1. Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1. Cân 10,0 g mẫu thủy sản đã được nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml (4.1.7). Thêm 100 ml dung dịch M - CAP làm việc (4.3.5) và 20 ml etyl axetat (4.2.1) vào trong ống rồi nghiền bằng máy nghiền đồng thể (4.1.11) trong khoảng 10-15 giây. Sau đó, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Gạn dịch trong vào bình quả lê 100 ml (4.1.6).
5.1.2. Cho thêm 20 ml etyl axetat (4.2.1) vào phần cặn trong ống ly tâm rồi trộn đều. Sau đó, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Gạn dịch trong vào bình quả lê ở trên.
5.1.3. Có dịch trong bình quả lê trên máy cô quay chân không (4.1.3) cho đến khi còn khoảng 2,0 - 4,0 ml dung dịch ở nhiệt độ 500c. Chuyển dịch còn lại sang ống ly tâm 50 ml bằng pipet Pasteur. Rửa bình quả lê 3 lần, mỗi lần bằng 2,0 ml etyl axetat. Tất cả dịch rửa được cho vào ống ly tâm.
5.1.4. Cô cạn dung dịch trong ống ly tâm bằng dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 0c
5.1.5. Thêm 25 ml dung dịch muối NaCl 4 % (4.3.1), 2 ml metanol (4.2.9) và 15 ml hexan (4.2.3) vào ống ly tâm. Đậy nắp ống ly tâm và lắc thật mạnh trong 1 phút. Sau đó, ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 800 vòng/phút.
35.1.6. Loại bỏ lớp hexan ở trên bằng pipet Pasteur (4.1.8). Lặp lại quá trình này thêm 2 lần, mỗi lần 15 ml hexan.
5.1.7. CAP trong pha nước được chuyển sang pha hữu cơ bằng cách lắc mạnh với 15 ml etyl axetat (4.2.1) trong 30 giây. Ly tâm hỗn hợp trong 1 phút ở tốc độ 800 vòng/phút. Dùng pipet Pasteur chuyển lớp etyl axetat ở trên vào bình quả lê 100 ml (4.1.6). Lặp lại quá trình này một lần nữa với 15 ml etyl axetat (4.2.1). Dịch chiết cũng được đưa vào bình quả lê.
5.1.8. Cô hỗn hợp dịch chiết (5.1.7) còn lại khoảng 2 - 4 ml trên máy quay chân không ở nhiệt độ 550c. Chuyển lượng dịch còn lại vào ống ly tâm 15 ml. Rửa bình quả lê 3 lần, mỗi lần với 2 ml etyl axetat. Cô cạn dịch thu được bằng dòng nitơ ở nhiệt độ 500c. Chuyển tiếp sang bước tạo dẫn xuất Sylyl theo Điều 5.4.
5.2. Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có cloramphenicol. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử quy định tại Điều 5.1.
5.3. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
Cho thêm 30,0 ml dung dịch chuẩn CAP 0,1m g/ml (4.8.7) và 30 m l dung dịch chuẩn M-CAP 0,1 m g/ml (4.3.8) vào 10,0g mẫu trắng rồi tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử quy định tại Điều 5.1.
5.4. Tạo dẫn xuất Sylyl
Thêm 100 m l Sylon (4.2.6) vào cặn trong ống ly tâm, đóng nắp rồi lắc mạnh trên máy rung trộn mẫu (4.1.10). Đặt ống ly tâm vào trong bể điều nhiệt (4.1.12) ở nhiệt độ 55 0c trong 40 phút: Làm bay hơi dung dịch trong ống cho đến gần khô (lưu ý không để khô hoàn toàn) dưới dòng nitơ tại nhiệt độ trong phòng. Thêm 500m l toluen rồi lắc mạnh cho tan cặn hoàn toàn.
5.5. Tiến hành phân tích trên hệ thống GC
5.5.1. Điều kiện phân tích
Đặt chế độ làm việc cho hệ thống GC như sau:
a) Chương trình nhiệt độ cột:
Tăng từ nhiệt độ 1500C lên nhiệt độ 2700C Với tốc độ 200 0 C/phút, giữ 8,5 phút.
Tăng từ nhiệt độ 2700C lên nhiệt độ 2900C Với tốc độ 200C/phút, giữ 2,0 phút.
b) Nhiệt độ đầu tiêm: 2700C:
c) Nhiệt độ detector: 3400C.
d) Tốc độ dòng khí mang He: 1 ml/phút.
đ) Khí bổ trợ: N2 theo điều kiện của GC.
e) Thể tích tiêm: 1 m l.
5.5.2. Ổn định cột sắc ký trong 3 giờ tại chế độ làm việc.
5.5.3. Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất (4.3.6) trước và sau mỗi 5 dung dịch thử. Xác định tỷ số diện tích pic (CAP/M-CAP).
5.5.4. Tiêm các dung dịch đã được tạo dẫn xuất của mẫu thử, mẫu trắng, mẫu xác định độ thu hồi vào hệ thống GC mỗi mẫu 2 lần. Tính kết quả thu được theo Điều 6.
5.6. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích
5.6.1. Độ lặp lại của 2 lần tiêm
Độ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
5.6.2. Độ thu hồi (R)
Độ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu. Độ thu hồi tính được phải lớn hơn 80%.
5.6.3. Kiểm tra xác nhận (confirmatory test)
Đối với các mẫu đã phát hiện Cloramphenicol bằng phương pháp GC-ECD này, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng GC-MS.
Hàm lượng cloramphenicol (C CAP) được tính theo công thức:
CCAP = | X x C x V |
Y x W |
Trong đó:
X là tỷ số trung bình diện tích pic (CAP/M- CAP) cho dung tích mẫu thử.
C là hàm lượng của CAP trong dung dịch các chuẩn đã được dẫn xuất (4.3.6), tính theo ng/g.
V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử, tính theo ml.
Y là tỷ số diện tích trung bình CAP/M-CAP trong dung dịch các chuẩn đã được dẫn xuất (4.3.6).
W là khối lượng mẫu thử, tính theo g./.