Cosmetics - Analytical methods - Identification and determination of hydroquinon by
high-performance liquid chromatography (HΜLC)
Lời nói đầu
TCVN 13644:2023 được xây dựng trên cơ sở tham khảo ACM 003 - Identification and determination of hydroquinone in cosmetic products by thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HΜLC)
TCVN 13644:2023 do Viện Kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Lời giới thiệu
Hydroquinon là một hợp chất hydroxyphenolic, hay còn gọi là dihydroxybenzen.
Công thức phân tử: C6H6O2
Khối lượng phân tử; 110,11
ID IUPAC: Benzene-1,4-diol
Công thức cấu tạo:
Hydroquinon được biết đến rộng rãi như một tác nhân làm mất sắc tố gây đậm màu trên da và là lựa chọn hàng đầu trong điều trị bệnh nám, tàn nhang, đặc biệt đối với trường hợp bị nám ở lớp biểu bì.
Tuy nhiên hydroquinon cũng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn như: ban đỏ, ngứa, kích ứng và viêm da tiếp xúc dị ứng, bạc mỏng...
Theo quy định hiện nay trong các nước Asean, hydroquinon không được phép sử dụng trong mỹ phẩm, ngoại trừ trường hợp sử dụng trên móng nhân tạo với hàm lượng không quá 0,02%.
Một số phương pháp định tính, định lượng hydroquinon như phương pháp hóa học, sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao trong các dược điển.
Phương pháp phân tích này sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò PDA hoặc tương đương để định tính, định lượng hydroquinon trong sản phẩm mỹ phẩm.
MỸ PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH - ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG HYDROQUINON BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HΜLC)
Cosmetics - Analytical methods - Identification and determination of hydroquinon by
high-performance liquid chromatography (HΜLC)
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính và định lượng hydroquinon trong các sản phẩm mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HΜLC).
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử
Mẫu thử được chiết với hỗn hợp nước - methanol trong điều kiện gia nhiệt nhẹ để nóng chảy thành phần chất béo, hydroquinon trong dung dịch thu được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA hoặc tương đương.
Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương.
CẢNH BÁO: Công việc phân tích phải được tiến hành trong môi trường phòng thử nghiệm phù hợp, được trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng tay).
4.1 Methanol
4.2 Nước
4.3 Pha động, hỗn hợp methanol - nước (55:45)
4.4 Chất chuẩn, Hydroquinon
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA hoặc tương đương được trang bị bơm, hệ thống bơm mẫu tự động, bộ điều nhiệt cho cột, detector và phần mềm xử lý số liệu
5.2 Cột phân tích HΜLC, C18 (4,6 mm x 250 mm; 5 μm) hoặc tương đương.
5.3 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg
5.4 Máy lắc
5.5 Máy ly tâm
5.6 Bể cách thủy, duy trì được ở nhiệt độ 60 °C
5.7 Bình định mức, loại A với các dung tích khác nhau
5.8 Pipet thủy tinh, loại A với các dung tích khác nhau
5.9 Màng lọc PVDF, kích thước lỗ lọc 0,45 μm hoặc tương đương
5.10 Cốc có mỏ, 25 mL
LƯU Ý:
Thao tác cân và xử lý mẫu đối với chuẩn hydroquinon và mẫu thử phải được tiến hành tránh ánh sáng để giảm thiểu sự phân hủy.
Nếu không có sẵn các dụng cụ thủy tinh tránh ánh sáng, có thể sử dụng giấy nhôm để bao xung quanh.
6.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Cân chính xác 12,5 mg hydroquinon (4.4) vào bình định mức 50 mL (5.7), thêm 25 mL pha động (4.3) lắc để hòa tan, tiếp tục thêm pha động vừa đủ đến thể tích, trộn đều. Hút chính xác 5 mL dung dịch trên vào bình định mức 50 mL bổ sung pha động đến thể tích, trộn đều.
Chú ý: Dung dịch chuẩn chỉ pha khi dùng, và có thể pha loãng cho phù hợp với nồng độ trong dung dịch thử. Các bình định mức màu nâu nên được sử dụng.
6.2 Chuẩn bị dung dịch thử
- Cân chính xác khoảng 1,000 g mẫu thử vào cốc có mỏ 25 mL (5.10), thêm từ từ 25 mL phađộng (4.3), trộn đến khi đồng nhất, chuyển vào bình định mức 50 mL (5.7), lắc 1 min bằng máylắc (5.4), đặt trong bể cách thủy (5.6) khoáng 60 °C trong 15 min, sau đó lấy ra để nguội ở nhiệt độphòng, thêm pha động đến thể tích, trộn đều.
- Lọc qua màng lọc PVDF 0,45 μm (5.9) nếu cần ly tâm (5.5) trước khi lọc trong 10 min.
- Dịch lọc sử dụng không quá 24 h.
6.3 Xác định bằng HΜLC
6.3.1 Điều kiện sắc ký
- Cột: | C18 (5 μm, 250 x 4,6 mm) hoặc tương đương. |
- Pha động: | Hỗn hợp methanol - nước (55:45) (có thể điều chỉnh nếu cần) |
- Detector | PDA hoặc tương đương ở bước sóng 292 nm |
- Thể tích tiêm: | 20 μL |
- Tốc độ dòng | 1,0 mL/min |
6.3.2 Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn (6.1), dung dịch thử (6.2), ghi lại sắc ký đồ, diện tích pic, so sánhthời gian lưu và phổ UV sắc ký đồ nhận được của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
6.3.3 Tương thích hệ thống: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn đối chiếu, RSD % diện tích pic chính khôngđược quá 2,0 %.
Với RSD % = (Độ lệch chuẩn/giá trị trung bình) x 100 %
7.1 So sánh thời gian lưu và phổ hấp thụ UV của pic trong dung dịch thử với pic trong dung dịch chuẩn. Mẫu thử được xem là có hydroquinon khi xuất hiện pic của dung dịch thử có thời gian lưu khác biệt không quá 2,0 % so với thời gian lưu của pic tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn. Phổ hấp thụ UV của pic tương ứng trong dung dịch thử và phổ của pic hydroquinon trong dung dịch chuẩn có chỉ số tương đồng không ít hơn 95 %; độ tinh khiết không ít hơn 95 %.
7.2 Dựa vào diện tích pic hydroquinon tương ứng trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn để tính hàm lượng hydroquinon có trong mẫu thử theo công thức:
Trong đó:
H: hàm lượng hydroquinon trong mẫu mỹ phẩm, tính bằng % (kl/kl).
St: Diện tích pic hydroquinon từ dung dịch thử.
Sc: Diện tích pic hydroquinon từ dung dịch chuẩn.
mr: khối lượng mẫu thử (g).
mc: khối lượng của mẫu chuẩn (g).
D: Hệ số pha loãng = 0,1 (như điều kiện ở trên).
C: Hàm lượng hydroquinon của chất chuẩn (%)
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:
a) Tất cả thông tin cần thiết để nhận biết mẫu;
b) Tất cả thông tin cần thiết để nhận biết phòng thí nghiệm thực hiện thử nghiệm;
c) Viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) Ngày và quy trình lấy mẫu (nếu biết);
e) Ngày nhận mẫu phòng thí nghiệm;
f) Ngày kết thúc thử nghiệm;
g) Kết quả thu được và đơn vị biểu thị kết quả;
h) Bất kỳ thao tác nào không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.
i) Nhận dạng và chữ ký của người chịu trách nhiệm đối với báo cáo thử nghiệm.
Bảng A.1- Các giá trị thẩm định phương pháp HΜLC
Các thông số thẩm định | Giá trị |
1. Thời gian lưu | Khoảng 3 min |
2. Độ chụm | RSD = 1,63 % |
3. Độ đúng | Tỷ lệ phục hồi: 97,0 % - 98,7 % |
4. LOD | 7,5 μg/g |
5. LOQ | 25 μg/g |
Hình A.1- Sắc kí đồ và thông tin pic của hydroquinon
Phương pháp định tính hydroquinon bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
B.1 Phạm vi áp dụng
Phương pháp này dùng để định tính hydroquinon trong các sản phẩm mỹ phẩm
B.2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết khi áp dụng phương pháp này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử
B.3 Nguyên tắc
Hydroquinon xác định bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
B.4 Thuốc thử
Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích.
CẢNH BÁO: Công việc phân tích phải được tiến hành trong môi trường phòng thử nghiệm phù hợp, được trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng tay).
B.4.1 Ethanol, tuyệt đối
B.4.2 n-Hexan
B.4.3 Aceton
B.4.4 Toluen
B.4.5 Acid acetic băng
B.4.6 Dung dịch acid phosphomolybdic 5 % (kl/tt) trong ethanol
B.4.7 Dung dịch bạc nitrat 5 % (kl/tt) trong nước
B.4.8 Dung dịch amoni hydroxyd (NH40H) 25 % (kl/kl)
B.4.9 Dung môi triển khai
Hệ1: n-hexan - aceton (3:2)
Hệ 2: Toluen - acid acetic băng (8:2)
B.4.10 Chất chuẩn, Hydroquinon
B.4.11 Thuốc thử phát hiện
Thuốc thử 1: Thêm amoni hydroxyd (B.4.8) vào dung dịch bạc nitrat 5 % (B.4.7) đến khi tủa tan.
Cảnh báo: dung dịch trở nên không ổn định khi dùng một thời gian và nên bỏ đi sau khi sử dụng.
Thuốc thử 2: Dung dịch acid phosphormolypdic 5 % trong ethanol (B.4.6).
B.4.12 Ethanol 96 % (tt/tt)
B.5 Thiết bị - dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
B.5.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg
B.5.2 Bể siêu âm
B.5.3 Bình định mức, loại A với các dung tích khác nhau
B.5.4 Pipet thủy tinh, loại A với các dung tích khác nhau
B.5.5 Cốc có mỏ, 25 ml
B.5.6 Màng lọc PVDF, kích thước lỗ lọc 0,45 μm hoặc tương đương
B.5.7 Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ từ 80 °C đến 100 °C
B.5.8 Bình sắc ký, có kích thước phù hợp với bản mỏng
B.5.9 Đèn soi UV, bước sóng 254 nm
B.5.10 Bản mỏng TLC, silica gel 60 F254 20 cm x 20 cm; bề dày 0,25 mm hoặc tương đương
B.5.11 Dụng cụ phun thuốc thử
B.5.12 Ống đong thủy tinh, loại A với các dung tích khác nhau
B.5.13 Mao quản chấm sắc ký - micropipet
B.6 Cách tiến hành
LƯU Ý:
Thao tác cân và xử lý mẫu đối với chuẩn hydroquinon và mẫu thử phải được tiến hành tránh ánh sáng để giảm thiểu sự phân hủy.
Nếu không có sẵn các dụng cụ thủy tinh tránh ánh sáng, có thể sử dụng giấy nhôm để bao xung quanh.
B.6.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Cân chính xác khoảng 50 mg hydroquinon (B.4.10), chính xác đến 0,1 mg vào bình định mức 25 mL (B.5.3), thêm 5 mL ethanol 96 % (B.4.12) lắc để hòa tan, tiếp tục thêm ethanol 96 % đến thể tích, trộn đều.
B.6.2 Chuẩn bị dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 1,5 g mẫu thử, cho vào cốc có mỏ 25 mL (B.5.5), thêm dần 15 mL ethanol 96 % trộn đều, chuyền vào bình định mức 25 mL (B.5.3), siêu âm (B.5.2) đồng nhất trong 10 min, đề nguội đến nhiệt độ phòng, thêm ethanol 96 % vừa đủ đến thể tích, trộn đều, đặt trong nước đá đến khi chất béo tách ra (khoảng 10 min), lọc qua màng lọc 0,45 μm (B.5.6).
B.6.3 Tiến hành sắc ký
B.6.3.1 Hoạt hóa bàn mỏng (B.5.10) trong 10 min ở 100 °C.
B.6.3.2 Bão hòa 2 bình sắc ký (B.5.8) với 2 hệ dung môi 1 và 2 (B.4.9)
B.6.3.3 Chấm lên bản mỏng (B.5.10) 20 μL của các dung dịch thử; 20 μL dung dịch chuẩn đối chiếu; dung dịch mẫu thêm chuẩn gồm dung dịch thử - dung dịch chuẩn với tỷ lệ (1:1) (Nếu vết quá lớn, có thể giảm thể tích chấm, ví dụ khoảng 2÷5 μL).
B.6.3.4 Triển khai bản mỏng sắc ký khoảng 15 cm (tránh ánh sáng)
B.6.3.5 Lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng
B.6.3.6 Phát hiện
B.6.3.6.1 Quan sát bản mỏng dưới đèn soi UV, bước sóng 254 nm (B.5.9), đánh dấu vị trí của cácvết.
B.6.3.6.2 Phun thuốc thử hiện màu (B.5.11)
- Thuốc thử 1 (bạc nitrat) (B.4,11) tạo vết đen.
- Thuốc thử 2 (acid phosphormolybdic) (B.4.11), sau khi sấy bản mỏng ở 100 °C trong khoảng 10 min (nếu cần) sẽ cho vết màu xanh dương.
B.7 Đánh giá kết quả
B.7.1 Tính giá trị Rf các vết sau khi sắc ký. bằng công thức sau:
Trong đó:
a: khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết.
b: khoảng cách đường đi của dung môi.
Quan sát vị trí và màu sắc, các vết sắc ký khi soi đèn và sau khi phun thuốc thử của dung dịch thử thử và dung dịch chuẩn.
B.7.2 Thực hiện phân tích bằng phương pháp HΜLC được mô tả trong tiêu chuẩn và so sánh thời gian lưu thu được đối với pic trong sắc ký đồ của dung dịch thử với pic trong trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
B.7.3 Lưu ý: Thông tin tham khảo
Bảng B.1- Vị trí và LOD của phương pháp TLC
STT | Hệ dung môi | Rf | LOD (μg/g) |
1 | n-hexan - aceton (3:2) | 0,3 | 100 |
2 | Toluen - acid acetic băng (8:2) | 0,2 | 150 |